Практикум-фотосинтез

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4 «ФОТОСИНТЕЗ»

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Физиология растений – наука, изучающая закономерности протекания физиологических процессов в онтогенезе растительного организма и принципы его взаимодействия с окружающей средой. В ходе онтогенеза растительные организмы реализуют программу, закодированную в геноме. Тем не менее, совокупность экспрессирующихся генов на каждом этапе развития, а также интенсивность протекающих метаболических процессов находятся под контролем постоянно изменяющихся внешних и внутренних факторов. К внутренним факторам, влияющим на процессы роста и развития, относятся, прежде всего, фитогормоны, к внешним температура, свет, вода, минеральные элементы и др. Именно факторы внешней среды играют определяющую роль в фенотипическом проявлении конкретного генотипа растения.

Практические занятия по физиологии растений включают выполнение задач по темам основных разделов теоретического курса, направлены на расширение представлений студентов об основных процессах, протекающих в растениях и механизмах их регуляции. В процессе выполнения задач у студентов должны сформироваться навыки научноисследовательской работы: постановка цели опыта, работа с реактивами и оборудованием, оформление документации, обсуждение результатов, формулировка выводов.

Выполнение лабораторных работ планируются по разделам «Физиология растительной клетки», «Водный режим», «Мембранный транспорт», «Фотосинтез», «Дыхание» «Обмен веществ, ферменты». На летней полевой практике – по разделу «Рост и развитие растений», «Стресс и устойчивость».

На выполнение каждой работы отводится 2 академических часа. Перед выполнением лабораторной работы студенты должны ознакомиться с соответствующими теоретическими разделами методического пособия и ходом выполнения задачи. По окончании выполнения работы студенты предъявляют преподавателю законченный эксперимент, записывают в рабочую тетрадь результаты опытов, выводы и получают отметку о выполнении.

Рекомендуемая литература для самостоятельной подготовки:

1.Медведев С.С. Физиология растений: учебник. СПб: БХВ-Петербург, 2013 – 512 с.

(www.bhv.ru)

2.Медведев С.С. Физиология растений. - СПб.: Изд-во СПбГУ, 2004. - 347 с.

3.Физиология растений: учебник для студ. вузов / под. ред. И.П.Ермакова. 2-е изд., испр. – М.: Изд.центр «Академия», 2007. – 640 с.

4.Кузнецов Вл.В. Физиология растений. Учебник. – М.: Абрис, 2011. - 783 с.

Преподаватель – к.б.н. Смоликова Галина Николаевна Дополнительная информация: http://smolikova.jimdo.com/

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Получение спиртовых экстрактов пигментов зеленого листа

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Объект: зеленые листья растений

Реактивы: 96%-ный этиловый спирт (С2Н5ОН), мел (СаСО3), кварцевый песок

Оборудование: ступка, воронка, круглый бумажный фильтр, стеклянная палочка, сосуд (30-50 мл) с плотно притирающейся крышкой, мерный цилиндр (25-50 мл).

Ход работы: Взвесить навеску листьев (1 г). Листья тщательно растереть в ступке с 2-3 мл этилового спирта, небольшим количеством кварцевого песка (для лучшего измельчения тканей) и небольшим количеством мела (для нейтрализации кислот клеточного сока). Полученную однородную массу перенести из ступки на воронку с бумажным фильтром. Чтобы жидкость при выливании лучше стекала, приставить к носику ступки стеклянную палочку. Конец воронки опустить в сосуд. Чтобы собрать всю зеленную массу, ступку и фильтр ополаскивают несколько раз небольшими порциями спирта (по 2–3 мл). Извлечение пигментов спиртом проводят до тех пор, пока стекающий из воронки раствор не будет бесцветным. Объем экстракта в сосуде довести спиртом до 25 мл, перемешать и плотно закрыть крышкой.

Полученный зеленый раствор содержит следующие пигменты: хлорофиллы а и b,

α и -каротины, ксантофиллы (лютеин, неоксантин, зеаксантин, антераксантин, виолаксантин).

COOCH3

СООС20Н39

Хлорофиллы

COOCH3

СООС20Н39

каротины: С40Н56

Каротиноиды

ксантофиллы: С40Н56О2

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Задача 4.1. Изучение состава пигментов зеленого листа

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Объект: спиртовой экстракт пигментов зеленого листа

Реактивы: 96%-ный этиловый спирт (С2Н5ОН), бензин, 10%-ный раствор соляной кислоты (НCl), 20%-ный раствор щелочи (NaOH), кристаллы уксусно-кислой меди

Оборудование: водяная баня, пипетка, штатив с пробирками

1)Разделение хлорофиллов и ксантофиллов (метод Крауса):

Метод основан на различной растворимости пигментов в этиловом спирте и бензине, которые при сливании не смешиваются, образуя два слоя: верхний – бензин; нижний – спирт. Хлорофилл является сложным эфиром дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов – метанола и фитола. Фитол имеет длинную углеводородную цепочку (С20Н39), которая и определяет гидрофобность молекулы хлорофилла. Он лучше растворяется в гидрофобном растворителе – бензине. Каротин, будучи углеводородом (С40Н56), также обладает гидрофобными свойствами и имеет большое сродство к бензину. Ксантофиллы – спирты (С40Н56О2), и поэтому они лучше растворяются в этаноле.

В пробирку налить 3 мл спиртового экстракта пигментов зеленого листа и добавить 4 мл бензина. Пробирку встряхнуть и дать отстояться содержимому. При этом происходит расслоение раствора на фракции. Сверху собирается бензин с перешедшими в него хлорофиллами, которые окрашивают его в зеленый цвет, и каротинами (желтая окраска каротинов маскируется зеленой окраской). Нижний слой содержит этиловый спирт с растворенными ксантофиллами, который окрашивают его в желтый цвет. Если разделение пигментов происходит недостаточно четко, в пробирку можно надо добавить 1 каплю воды и снова сильно встряхнуть ее (избытка воды следует избегать, так как может произойти помутнение раствора).

2) Разделение хлорофиллов и каротинов (путем омыления щелочью):

Хлорофилл является сложным эфиром дикарбоновой кислоты хлорофиллина и двух спиртов – метанола и фитола. Сложные эфиры способны вступать в реакцию со щелочью, при этом их молекула расщепляется на кислоту и спирт (реакция омыления). Образующаяся при омылении хлорофилла натриевая соль хлорофиллиновой кислоты сохраняет зеленую окраску, но приобретает гидрофильные свойства и способность растворяться в спирте. Каротиноиды при действии щелочи не изменяют своей химической природы.

Аккуратно пипеткой отобрать 2 мл полученной верхней фракции бензина (с содержащимися в ней хлорофиллами и каротинами) и поместить их в другую пробирку. Прилить туда 1-2 капли щелочи (NaОН) и перемешать. Пробирку нагреть на водяной бане до закипания в ней раствора и затем охладить. После охлаждения добавить в пробирку 2 мл этилового спирта, тщательно встряхнуть содержимое встряхнуть и затем дать отстояться. В результате в пробирке должны присутствовать два слоя. Верхний слой бензина будет содержать каротины, которые окрасят его в желтый цвет. Нижний слой спирта будет содержать хлорофиллы, которые окрасят его в зеленый цвет.

2

3) Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла

Хлорофилл относится к Mg-порфиринам. Главной частью его молекулы является порфириновое ядро, состоящее из четырех пиррольных колец. Их вершины с атомами азота направлены к центру порфиринового ядра и взаимодействуют с атомом магния, занимающим центральное положение. Магний в порфириновом ядре удерживается непрочно и при воздействии кислот может быть замещен на два атома водорода.

Хлорофилл с замещенным на водород атомом магния называется феофитином.

Феофитин имеет бурый цвет. Водород в порфириновом ядре феофитина также удерживается непрочно и при воздействии солей может быть снова замещен металлом (при этом восстанавливается зеленая окраска пигмента). Процесс феофитинизации может наблюдаться в природе при повреждении листьев под действием стрессов и внешне проявляется в побурении листьев.

Аккуратно пипеткой отобрать верхний, содержащий каротины, слой бензина в другую пробирку. К оставшемуся нижнему слою спирта, который содержит хлорофиллы и окрашен в зеленый цвет, добавить 1-2 капли 10%-ной соляной кислоты. Зеленая окраска раствора изменится на бурую, так как образовался феофитин. Затем добавить в раствор небольшой кристаллик уксуснокислой меди и нагреть раствор на водяной бане до кипения. Бурый цвет раствора изменится на зеленый, так как произошла реакция меди с хлорофиллов: атом водорода в порфириновом кольце феофитина заменился на атом меди.

Результаты всех наблюдений записать и объяснить.

Ответить на вопросы:

Строение хлоропластов (перечислить)___________________________________________

____________________________________________________________________________

Общее уравнение фотосинтеза _________________________________________________

____________________________________________________________________________

Функции каротиноидов________________________________________________________

____________________________________________________________________________

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Задача 4.2. Разделение пигментов зеленого листа методом бумажной хроматографии

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Объект: спиртовой экстракт пигментов зеленого листа

Реактивы: петролейный эфир, 96-ный этиловый спирт

Оборудование: высокий цилиндр с крышкой, стеклянная камера для хроматографии с крышкой, лист хроматографической бумаги (16х16 см)

Ход работы: Разделение пигментов методом бумажной хроматографии основано на разной скорости движения пигментов с током растворителя при нанесении на бумагу.

На полоске хроматографической бумаги, на расстоянии 1,5 см от ее края, простым карандашом провести линию (стартовая линия). В стеклянный стаканчик налить 3–5 мл спиртового экстракта пигментов зеленого листа. В стаканчик с экстрактом опустить кончик полоски хроматографической бумаги и держать его вертикально до тех пор, пока раствор пигментов не поднимется до стартовой линии. После этого бумагу подсушить на воздухе и снова погрузить в стаканчик с экстрактом пигментов (операцию нанесения пигментов и последующего подсушивания бумаги повторить 10 раз). При каждом нанесении фронт пигментов должен подниматься до стартовой линии, где образуется яркая

зеленая полоса. По окончании этой процедуры конец полоски хроматографической бумаги 2–3 раза опускают в этиловый спирт (подсушивая после каждого опускания) для того, чтобы пигменты, не успевшие подняться до стартовой линии, достигли ее.

Полоску бумаги с собранными на стартовой линии пигментами помещают в высокий цилиндр, на дно которого налит петролейный эфир. Растворитель (петролейный эфир) не должен касаться стартовой зоны нанесения пигментов. Цилиндр сверху покрывают пришлифованной крышкой. Через 15-20 мин хроматограмму вынимают из цилиндра и подсушивают на воздухе.

Пигменты разделяются на ней в виде полос, которые располагаются в следующем порядке: хлорофилл b, хлорофилл а, смесь ксантофиллов и высоко с фронтом раствори-

теля движется каротин (см.рисунок).

Полученную хроматограмму вклеить в тетрадь и подписать полосы пигментов.

3

Ответить на вопросы:

Стадии фотосинтеза (перечислить)______________________________________________

____________________________________________________________________________

Белковые комплексы мембран тилакоидов (перечислить)___________________________

____________________________________________________________________________

Что такое «S-цикл»? __________________________________________________________

____________________________________________________________________________

Z-схема фотосинтеза (дать определение и перечислить этапы) ______________________

____________________________________________________________________________

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Задача 4.3. Изучение спектральных свойств фотосинтетических пигментов

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Объект: зеленые листья растений

Реактивы: 96%-ный этиловый спирт (С2Н5ОН), мел (СаСО3), кварцевый песок

Оборудование: ступка, воронка, круглый бумажный фильтр, стеклянная палочка, сосуд (30-50 мл) с плотно притирающейся крышкой, мерный цилиндр (50 мл), пробирка, пипетка, электрическая лампа, черная светонепроницаемая бумага, бюкс с крышкой, спектроскоп (закрепленный в держателе штатива), ФЭК, кюветы

Ход работы:

Получить спиртовой экстракт пигментов зеленых листьев (ход работы описан выше). Записать в таблицу массу листьев (Р) и конечный объем экстракта (V).

1) Количественное определение содержания хлорофиллов колориметрическим методом

Для количественного определения содержания пигментов листа используют фотоэлектроколориметры (ФЭК) или спектрофотометры (СФ). СФ – более точный прибор, поскольку позволяет оценивать оптическую плотность растворов при заданной длине волны и на основании полученных данных и величин молярного или удельного коэффициента погашения рассчитывать концентрацию веществ. Принцип ФЭК заключается в том, что световой поток проходит через кювету с раствором и попадает на фотоэлемент, который превращает световую энергию в электрическую. Чем более концентрирован раствор, тем больше лучей он поглощает и тем слабее будет возникающий в фотоэлементе ток. Сравнивая чистый растворитель (контроль) и раствор (опыт), по разнице силы тока можно определить концентрацию исследуемого вещества. При работе с ФЭК предварительно составляется калибровочная кривая, для которой в качестве стандарта берут серию растворов с известными концентрациями исследуемого вещества.

Спиртовой экстракт пигментов зеленого листа налить в стеклянную кювету и измерить его оптическую плотность на ФЭКе, установив красный светофильтр. Контролем служит чистый растворитель, в котором происходила экстракция пигментов (этанол). Результаты оптической плотности (D) записать в таблицу.

Показания оптической плотности должны находиться в пределах от 0,1 до 0,4. Если D ≥ 0,5, то экстракт следует развести растворителем. Если D ≤ 0,09, то экстракт следует переделать, увеличив массу навески.

Зная результаты оптической плотности, рассчитать концентрацию хлорофиллов в 1 мл раствора (С) по калибровочному графику.

Для построения калибровочного графика предварительно готовят серию стандартных растворов хлорофиллов возрастающей концентрации и находят оптическую плотность каждого из них. Затем на оси абсцисс (Х) откладывают значения концентрации (мг/мл), а на оси ординат (У) – соответствующие значения оптической плотности. Точки пересечения соединяют и получают кривую.

Рассчитать содержание суммы хлорофиллов в экстракте (Хл) по формуле:

Хл = (С * V) / P

4

Хлорофилл легко возбуждается при поглощении света и обладает способностью передавать энергию (служить донором энергии) другим молекулам (акцепторам энергии). Запасание энергии света связано с поглощением кванта света (фотона) и переходом молекулы хлорофилла из основного (So) в возбужденное состояние. Если при поглощении кванта света спины электронов остаются антипараллельными, молекула хлорофилла переходит в синглетное возбужденное состояние (S1 или S2). Синглетное возбужденное состояние S2 очень нестабильно: электрон быстро (10-12с) теряет часть энергии в виде тепла и переходит на нижний уровень (S1), где может находиться уже в течение 10-9 – 10-8с. Возвращение молекулы хлорофилла из синлетного возбужденно-

го в основное невозбужденное состояние с излучением кванта света называется флуоресценцией. Хлорофилл флуоресцирует в красной части спектра с максимумом испускания 670 нм. Энергия синглетного возбужденного состояния молекулы хлорофилла используется в ходе фотосинтеза в фотохимических реакциях и трансформируется в энергию химических связей органических соединений.

В пробирку налить 3-5 мл спиртового экстракта пигментов зеленого листа и рассмотреть в отраженном свете. Для этого: а) поместить пробирку у освещенной электрической лампы и рассмотреть с той стороны, откуда падает свет; б) поставить за пробирку черную бумагу и рассмотреть.

Записать в тетради наблюдения и объяснить причины наблюдаемого явления. Объяснить, почему мы наблюдаем сильную флуоресценцию хлорофиллов в растворах и слабую флуоресценцию в интактных листьях.

3) Изучение спектров поглощения пигментов при помощи спектроскопа

В стеклянную кювету налить спиртовой экстракт пигментов зеленого листа и расположить кювету на уровне глаз между спектроскопом и источником света (электрической лампой). Рассмотреть раствор в кювете через окуляр спектроскопа. Результаты наблюдений занести в таблицу, в которой заштриховать поглощенные (черные) участки спектра:

Каротины*

*экстракты чистых хлорофиллов, каротинов и ксантофиллов взять у студентов, выполняющих задачу 4.2.

5

Ответить на вопросы:

С3-путь фотосинтеза (перечислить стадии) _______________________________________

____________________________________________________________________________

Функции РУБИСКО__________________________________________________________

____________________________________________________________________________

Особенности строения листьев С4-растений (перечислить)__________________________

____________________________________________________________________________

Фермент, осуществляющий фиксацию СО2 у С4-растений__________________________

____________________________________________________________________________

Особенности С4-фотосинтеза у САМ-растений____________________________________

____________________________________________________________________________

В каких органеллах клетки осуществляется С2-путь фотосинтеза?____________________

____________________________________________________________________________