Ферменты синтеза нуклеотидов как мишени действия противовирусных и противоопухолевых препаратов
95. Распад пиримидиновых нуклеотидов: схема, ферменты.
Распад пиримидиновых нуклеотидов
Нарушение обмена пиримидиновых нуклеотидов
Оротовая ацидурия (оротацидурия или оранжевая кристаллоурия) может быть наследственной и приобретенной.
Наследственная форма
Наследственная форма оротовой ацидурии весьма редка связана с одновременным дефектом оротатфосфорибозилтрансферазы и оротидилдекарбоксилазы, так как эти ферменты являются двумя активными центрами одного белка. Заболевание проявляется на втором полугодии жизни гипохромной мегалобластической анемией, лейкопенией, отставанием умственного и физического развития. Диагноз ставится при обнаружении в охлажденной моче оранжевых игольчатых кристаллов оротовой кислоты. Болезнь осложняется тем, что при недостатке УТФ и ЦТФ активируются первые реакции синтеза оротовой кислоты. При отсутствии лечения гибель наступает в первые годы жизни.
Однако, так как первопричиной заболевания является "пиримидиновый голод", его можно достаточно успешно корректировать с помощью приема уридина, при этом серьезно не опасаясь передозировки.
Приобретенная форма
Эта более частая форма оротовой ацидурии может наблюдаться:
при дефекте каких-либо ферментов синтеза мочевины, кроме карбамоилфосфатсинтетазы. При этом карбамоилфосфат митохондрий (в норме используемый для образования мочевины) выходит из них и используется для избыточного синтеза оротовой кислоты. Заболевание обычно сопровождается гипераммониемией.
при лечении подагры аллопуринолом, который превращается в оксипуринолмононуклеотид, являющийся ингибитором оротатдекарбоксилазы, что опять же ведет к накоплению оротата.
96. Репликация – синтез днк: матрица, затравка, субстраты, кофактор, ферменты и белки репликации.
Репликация ДНК - процесс, осуществляемый комплексом ферментов и белков, образующих идентичные копии ДНК для передачи генетической информации в поколениях клеток и организмов. Синтез ДНК в клетке происходит не беспорядочно, а в строго определенный период жизни клетки. Всего выделяют 4 фазы: митоз (М), синтетическую (S), пресинтетическую (G1, от англ. gap - интервал), постсинтетическую (G2). Важное участие в регуляции смены фаз клеточного цикла занимают циклины – белки массой 35-90 кДа, уровень которых меняется в ходе клеточного цикла. По функции циклины – это активаторные субъединицы ферментов циклин-зависимых киназ (ЦЗК). Активные комплексы циклин-ЦЗК фосфорилируют внутриклеточные белки, изменяя их активность. Этим обеспечивается продвижение по клеточному циклу.
Принципы репликации:
Комплементарность.
Антипараллельность.
Униполярность.
Полуконсервативность
Потребность в затравке.
Прерывистость.
Синтез каждой дочерней цепи ДНК идет комплементарно и антипараллельно матричной цепи и всегда в направлении 5'→3'.
Полуконсервативность означает, что каждая дочерняя ДНК состоит из одной матричной цепи и одной вновь синтезированной.
Доказательство полуконсервативного характера репликации
Для выяснения вопроса о характере расхождения цепей по дочерним молекулам Мэтт Мезельсон и Фрэнк Сталь в 1958 г. разработали метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности CsCl для разделения ДНК по удельной плотности. E. сoli выращивали на протяжении нескольких поколений на среде, содержащей тяжелый изотоп азота (N15) для того, чтобы вся ДНК была "тяжелой". Перед очередным раундом деления клетки в среде заменяли N15 на легкий изотоп N14 с тем, чтобы вновь синтезированные цепи были "легкими". После репликации ДНК выделяли и центрифугировали в градиенте плотности CsCl. Равное распределение "тяжелых" и "легких" цепей между всеми молекулами исключало возможность консервативного способа, согласно которому одна дочерняя клетка получает материнскую ДНК, а другая – вновь синтезированную, обе цепи которой являются новыми.
Матрицей для синтеза новых цепей служит одноцепочечная ДНК.
Затравкой является 3'-гидроксильный конец двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен с матрицей. Доказательством того, что затравка - 3'- гидроксильный конец, является эксперимент с дидезоксинуклеозидтрифосфатом. Если такой активированный нуклеотид сделать меченым по α-фосфату, то он включается в растущую полимерную цепь и всегда обнаруживается на ее 3'-конце. Это говорит о том, что он сам включается, но дальнейший рост цепи невозможен, т.к. нет 3'-гидроксильного конца. Это доказывает и униполярность репликации в направлении 5' →3'.
Прерывистость репликации происходит в виде фрагментов Оказаки. Синтез (репликация, удвоение) ДНК происходит в S-фазу клеточного цикла. Механизм репликации, как установили эксперименты Мэтью Мезельсон и Франклин Сталь в 1958 г, полуконсервативный, т.е. на каждой нити материнской ДНК синтезируется дочерняя копия. Весь процесс репликации идет в S-фазу клеточного цикла, в то время, когда клетка готовится к делению. Как матричный биосинтез, репликация требует наличия нескольких условий:
матрица – в ее роли выступает материнская ДНК;
растущая цепь – дочерняя ДНК;
субстраты для синтеза – dАТФ, dГТФ, dЦТФ, ТТФ;
источник энергии – dАТФ, dГТФ, dЦТФ, ТТФ;
ферменты.
Синтез ДНК начинается в определенных участках, получивших название точка ori (англ. origin - начало). На каждой ДНК млекопитающих точек ori насчитывается около 100. Репликация распространяется от этих участков в обе стороны по нитям ДНК с образованием "репликативных пузырей". В каждом таком "пузыре" имеются две "репликативные вилки", в которых происходит расплетание, раскручивание и непосредственный синтез ДНК. Репликативные вилки удаляются друг от друга. В целом вся репликация ДНК у эукариот заканчивается за 9 часов.
В каждой репликативной вилке идет синтез ДНК в направлении от 5'-конца к 3'-концу, т.е. 5'-конец новой ДНК остается свободным, следующие нуклеотиды присоединяются к 3'-гидроксильной группе предыдущего нуклеотида. Поскольку нити ДНК антипараллельны, то непрерывно синтезируется только одна нить, а именно та, на которой направление движения репликативной вилки совпадает с направлением 3' → 5'.
Оrigin (ori) - район начала репликации ДНК, содержит 4 шпильки, которые опознаются РНК-полимеразой и используются в качестве матрицы. По мере образования РНК шпилька плавится. Образуется РНК-затравка длиной 24 нуклеотида, 3'-конец которой используется ДНК полимеразой III.
Реплисома – комплекс ферментов для синтеза ДНК (ДНК-полимераза III, ДНК-полимераза I, лигаза).
Репликон - участок ДНК между двумя участками ori. Каждая эукариотическая хромосома – полирепликон.
По мере расплетания и движения репликативной вилки на нити открываются участки, где возможен синтез новой нити в направлении 5' → 3'. Направление 5' → 3' другой материнской нити ДНК совпадает с направлением движения репликативной вилки. Поэтому синтез дочерней нити (в направлении 5' → 3') возможен только после расплетания части ДНК и освобождения участка для синтеза. Таким образом, синтез дочерней ДНК на одной из нитей материнской ДНК идет фрагментарно. По имени японского исследователя синтезируемые на отстающей цепи отрезки ДНК назвали фрагменты Оказаки.
В целом для синтеза ДНК необходим ряд ферментов.
Топоизомеразы - ферменты, изменяющие топологию ДНК. Топоизомеразы меняют число зацеплений одной цепи за другую. Делятся на два класса: тип I (релаксазы) - уменьшают число зацеплений, тип II (гиразы) - увеличивают число зацеплений.
Гиразы вносят двуцепочечный разрыв ДНК по принципу работы рестриктаз.
Хеликазы - ферменты, денатурирующие (расплетающие) ДНК.
SSB белки (single strand bind) - связываются с одноцепочечной ДНК электростатически, когда в ДНК образуется расплавленный участок, не дают цепям схлопнуться. Они не денатурируют ДНК, а лишь фиксируют, удерживают матричные цепи ДНК в репликативной вилке.
Праймаза – фермент, создающий РНК-затравку для начала синтеза ДНК. У эукариот РНК-затравки размером 6-10 нуклеотидов удаляются РНК-азой. Бреши заделываются репарирующими ферментами.
Рестриктазы - эндонуклеазы, узнающие определенные последовательности, делают разрезы в обеих цепях ДНК, затем поворачивают концы ДНК на 360 и проявляет лигазную активность, т.е. сшивают цепи ДНК. При этом используется энергия АТФ. Результат деятельности гираз - супервитки. Суперспирализованная ДНК напряжена. В некоторых местах цепи расходятся, т.к. расплавляются А-Т участки.
