Методичка по биохимии. 1 курс - 1 модуль

I- этап: сближение и ориентации субстрата относительно актвного центра фермента;

IIэтап: образование фермент-субстратного комплекса (ES) в результате индуцированного соответствия.

IIIэтап: деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт (ЕР)

IVэтап: распад комплекса (ЕР) с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента.

7. Основы кинетики ферментативных реакций.

Химическая кинетика - это учение о скоростях и механизмах химических реакций. Ферментативная кинетика изучает закономерности влияния химической природы реагирующих веществ (фермента, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация фермента, концентрация субстратов или ингибиторов) на скорость ферментативных реакций.

Скорость ферментативной реакции – это мера каталитической активности фермента, которую обозначают как активность фермента. На практике пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента

Для выражения каталитической активности Комиссией по ферментам Международного биохимического союза (1961 г.) была рекомендована стандартная единица, обозначенная на русском языке - Е, а на английском - U.

одна международная единица активности фермента (МЕ) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля (мкмоль) субстрата за 1 мин при оптимальных условиях проведения ферментативной реакции. Международная единица активности (МЕ или Unit) выражается мкмоль/мин.

17

В 1973 году была принята новая единица активности ферментов: 1 катал (1 кат), соответствующий такому количеству катализатора, которое превращает 1 моль субстрата за 1 сек. Количество каталов определяют по формуле:

Международная единица связана с каталом равенством: 1МЕ=16,67 нкат (нонакатал).

В медицинской практике для оценки активности часто используют международные единицы активности, а для оценки количества молекул фермента в ткани определяют удельную активность (уд.ак.) фермента.

Удельная активность – выражается в единицах активности, рассчитанной на 1 мг белка по формуле:

Например, известно,

что 1 гпепсинарасщепляет 50 кг яичного белка за один час – таким образом, его активность составит 50 кг/час на 1 г фермента,

если 1,6 мл слюны расщепляет 175 кг крахмала в час – активность амилазы слюнысоставит 109,4 кг крахмала в час на 1 мл слюны или 1,82 кг/мин×г или 30,3 г крахмала/ с×мл.

8. Влияние температуры.

Важным фактором, от которого зависит скорость ферментативной реакции (равно каталитическая активность фермента) является температураКаждый фермент имеет свою оптимальную температуру. Для ферментов животного происхождения она лежит между 37 и 40ОС, а

18

растительного - между 40 и 50ОС. Однако есть и исключения: -амилаза из проросшего зерна имеет оптимальную температуру при 60ОС, а каталаза - в пределах 0 - 10ОС. До этого интервала с повышением температуры скорость катализируемой реакции повышается из-за ускорения движения молекул и увеличения вероятности их столкновения. Выше оптимальной температуры активность ферментов понижается, а при температуре 50-60оС совершенно прекращается, фермент инактивируется из-за денатурации. При температуре выше 80ОС большинство ферментов полностью теряют свою каталитическую активность. Поэтому важным показателем, характеризующим отношение фермента к температуре, является его термолабильность, т.е. скорость инактивации самого фермента при повышении температуры. При низких температурах (0 ОС и ниже) каталитическая активность ферментов падает почти до нуля, но денатурация при этом не происходит. С повышением температуры их каталитическая активность вновь восстанавливается.

Температура, обеспечивающая наибольшую скорость реакции, называется о п т и м а л ь н о й температурой.

Зависимость активности ферментов от температуры описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной температуры для данного энзима.

Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении температуры на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до температур денатурации белков. Наряду с этим, как исключение, имеются ферменты некоторых микроорганизмов, существующих в воде горячих источников и гейзеров.

При понижении температуры активность ферментов понижается, но не исчезает совсем. Иллюстрацией может служить зимняя спячка некоторых животных (суслики, ежи), температура тела которых понижается до 3-5°С. Это свойство ферментов также используется в хирургической практике при проведении операций на грудной полости, когда больного подвергают охлаждению до 22°С.

19

Рис. 1. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.

Влияние рН.

Для каждого фермента существует оптимальное значение рН, т.е. такая величина рН, или зона рН, при которой катализируемая ферментом реакция протекает с наибольшей скоростью.

Большинство ферментов имеют максимальную каталитическую активность в зоне рН от 7; в резко кислой или резко щелочной среде работают лишь некоторые ферменты. За пределами оптимальной зоны рН, т.е.

при отклонениях в сторону снижения или в сторону повышения от этого значения, скорость ферментативной реакции снижается.

При разных значениях рН активный центр может находиться в разной степени ионизированной или неионизированной форме, что сказывается на формировании активного фермент-субстратного комплекса. Кроме того, имеет значение факт ионизации субстатов и кофакторов.

При проведении производственных процессов можно путем соблюдения требуемого рН снизить активность нежелательных для процесса ферментов и повысить активность полезных ферментов.

Зависимость также описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при оптимальном для данного фермента значении рН. Для каждого фермента существует определенный узкий интервал рН среды, который является оптимальным для проявления его высшей активности. Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5, трипсина 8,0-8,5,

20

амилазы слюны 7,2, аргиназы 9,7, кислой фосфатазы 4,5-5,0, сукцинатдегидрогеназы 9,0.

Рис. 2. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды.

Зависимость скорости реакции от количества фермента.

При проведении ферментативной реакции в условиях избытка субстрата скорость будет зависеть прямо пропорционально от концентрации фермента.

Рис. 3. Зависимость скорость реакции от концентрации фермента.

При увеличении количества молекул фермента скорость реакции возрастает непрерывно и прямо пропорционально количеству фермента, т.к. большее количество молекул фермента производит большее число молекул продукта.

9. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.

Ферментативный процесс условно можно выразить уравнением:

21

где k1- константа скорости образования фермент-субстратного комплекса, k-1- константа скорости обратной реакции распада фермент-субстратного комплекса, k2- константа скорости образования продукта реакции. Соотношение констант (k-1+k2)/k1 называют константой Михаэлиса и обозначают: Кm.

Рис. 4. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата.

При увеличении концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента скорость реакции возрастает пропорционально увеличению концентрации субстрата (реакция первого порядка). При высоких концентрациях субстрата скорость реакции достигает своего максимального значение (Vmax) и не зависит от концентрации субстрата (реакция нулевого порядка). Графически эта зависимость описывается гиперболой. Эта кривая описывается уравнением Михаэлиса Ментен:

где Кm – константа Михаэлиса. Она численно равна той концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от

22

максимального значения. С помощью Кm можно охарактеризовать сродство данного фермента к данному субстрату. Чем меньше Кm, тем больше сродство фермента к данному субстрату и выше скорость реакции. Если Кm высока, то сродство фермента к такому субстрату низкое и реакция протекает медленно.

23

Тема: «Регуляция скорости ферментативных реакций»

Цель занятия: изучить типы изменения активности ферментов в зависимости от различных факторов. Ознакомиться с применением ферментов в медицине.

I.Теоретическая часть.

План:

1.Ингибирование активности ферментов: определение, классификация.

2.Виды ингибирования: обратимое, конкурентное, неконкурентное, необратимое.

3.Регуляция скорости ферментативных реакций:

изменением количества молекул фермента в клетке;

доступностью молекул субстрата и кофермента;

локализацией ферментов в определенном отсеке клетки (компартментализация);

4.Аллостерическая регуляция.

5.Регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий;

6.Регуляция частичным (ограниченным протеолизом).

7.Регуляция путем фосфорилирования/дефосфорилирования;

8.Энзимопатии.

9.Энзимодиагностика. Изоферменты.

1. Отличительной способностью ферментов является их способность под действием различных факторов изменять свою активность. Активность большинства ферментов подавляется множеством соединений, которые называют ингибиторами.

И н г и б и т о ры - вещества, вызывающие частичное или полное торможение химических реакций.

Снижение активности ферментов в присутствии ингибиторов называется

ингибированием.

Можно выделить два основных направления ингибирования:

по прочности связывания фермента с ингибитором ингибирование бывает: обратимым и необратимым;

по отношению ингибитора к активному центру фермента ингибирование делят на конкурентное и неконкурентное;

2. Обратимое ингибирование.

Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при определенных условиях легко отделяются от фермента. Обратимые ингибиторы бывают конкурентными и неконкурентными.

Различают два типа обратимого ингибирования фермента: конкурентное и неконкурентное.

Конкурентное ингибирование.

Когда ингибиторы имеют структуру, аналогичную структуре субстрата, то способны связываться с активным центром фермента. В этом случае наблюдается конкуренция между субстратом и ингибитором за связывание с одним и тем же центром,. Такой вид ингибирования называется конкурентным. Конкурентные ингибиторы обратимо связываются с активным центром фермента и конкурируют с субстратом за активный центр. Если активный центр фермента занят ингибитором, то он не способен связывать субстрат и скорость реакции уменьшается.

Конкурентный ингибитор реагирует с ферментом с образованием комплекса фермент-ингибитор. В отличие от фермент-субстратного комплекса

ингибитор не превращается в продукт. Для конкурентного типа ингибирования справедливы уравнения:

E + S ES --> E + P;

E + I EI;

Скорость реакции ингибирования зависит от соотношения ингибитор:субстрат в реакционной среде. При отношении ингибитор:субстрат = 1: 50 степень ингибирования фермента составляет 50%. Увеличение концентрации субстрата при постоянной концентрации ингибитора снижает степень ингибирования. Напротив, понижение концентрации субстрата увеличивает степень ингибирования.

Классическим примером конкурентного ингибирования является действие малоновой кислоты на сукцинатдегидрогеназу.

Сукцинатдегидрогеназа - это фермент из группы ферментов, катализирующих реакции цикла трикарбоновых кислот (цикл Кребса). Этот фермент катализирует отщепление 2-х атомов водорода от 2-х метиленовых углеродов янтарной кислоты (сукцината).

НООС-СН2-СН2-СООН + акцептор НООС-СН=СН-СООН

Многие соединения, сходные структурно с янтарной кислотой, но не способные дегидрироваться, могут соединяться с ферментом, блокировать его и тормозить протекание нормальной реакции. Такими соединениями могут быть малоновая кислота, глутаровая кислота, щавелевая кислота.

Из этих трех кислот наиболее мощным ингибитором сукцинатдегидрогеназы является малоновая кислота.