диссертации / 129

51

дистонические нарушения (12,5%) и гипотония (10,7%) встречались реже. У 83% пациентов наблюдались симптомы поражения вестибулярно-мозжечковой системы: наиболее часто наблюдалась динамическая и/или статическая атаксия

(сочетания динамической и статической атаксии – 49%, динамическая атаксия –

4,5%, статическая атаксия – 6,3%), реже – мимопопадание и/или интенционный тремор при пальценосовой и пяточно-коленной пробе, гиперметрия и дисметрия (мимопопадание 7,1%, интенционный тремор 5,4%, сочетание –

10,7%). Симптомы поражения черепных нервов при осмотре были выявлены у

55,4% пациентов, причем наиболее часто наблюдались нарушения глазодвигательных нервов (22,3%), реже – нарушения со стороны бульбарной группы нервов (11,6%), лицевого нерва (8%), тройничного нерва (4,5%), других ЧМН (9%). Чувствительные расстройства на момент исследования обнаружились у 34,8% пациентов, наиболее частыми их проявлениями было нарушение глубокой чувствительности (17,9%), чуть реже – проводниковые чувствительные расстройства (16,9%). Нарушения функции тазовых органов проявлялись в виде императивных позывов (11,6%), учащения (25,9%) либо задержки мочеиспускания (5,4%) и отмечались у 33,8% обследованных

(сочетанные расстройства функций тазовых органов наблюдались в 9%

случаев). Неврологический статус пациентов оценивался по Расширенной Шкале Инвалидности (EDSS) и Шкале Функциональных Систем (FS),

основанных на шкалах J.F. Kurtzke, которые на настоящий момент являются основными для оценки неврологического дефицита при рассеянном склерозе.

Балл по шкале EDSS у обследованных пациентов колебался от 1,0 до 7,0 и в среднем составил 3,26±0,19 (Ме=2,5, Мо=1, квартиль=3,5) (см. таблицу 2.7).

Таблица 2.7. Вовлеченность функциональных систем в исследуемой группе больных РС.

52

2. Характеристики используемых методов оценки клинических,

неврологических, инструментальных и лабораторных методов.

2.1 Оценка клинических методов исследования.

Все пациенты РС проходили клинико-демографическое и эпидемиолого-

социальное обследование: возраст, пол, индекс массы тела (расчет

производился по формуле , определение частоты сердечных сокращений, артериального давления; курение в анамнезе и на момент исследования, наличие/отсутствие злоупотребления алкоголем, наличие сопутствующих заболеваний, наличие/отсутствие дислипидемии).

2.2 Оценка неврологических проявлений РС.

Все больные РС проходили комплексную неврологическую оценку функциональных систем по шкале J.F. Kurtzke, оценку неврологического статуса по Расширенной Шкале Инвалидности (EDSS) – см. приложение.

53

2.3 Характеристика инструментальных методов исследования.

43 пациентам с РС (30 пациентов с РРС, 9 с ВПРС, 4 с ППРС) проводилось определение сосудодвигательной функции с помощью УЗ-диагностики при проведении пробы с реактивной гиперемией по методу Celermajer (1992) на базе кабинета ультразвуковых исследований ГБУЗ ЯО КБ №8 с использованием аппарата Siemens ACUSON X300 PE. Проба с реактивной гиперемией основана на установленном факте увеличения диаметра артерии в ответ на увеличение скорости тока крови, приводящего к увеличению напряжения сдвига, воздействующего на эндотелий. При эндотелиальной дисфункции у больных происходит уменьшение вазодилатации или патологическая вазоконстрикция, также при этом происходит утолщение комплекса «интима-медиа», а на более поздних стадиях – атеросклеротические изменения сосудов [24, 44].

Исследование проводилось после 15-20 минутного пребывания пациента в состоянии покоя. Протокол ультразвукового исследования включал следующую информацию: толщина комплекса интима-медиа на участке общей сонной артерии перед ее бифуркацией с двух сторон (в норме до 7 мм), наличие склерозирования и атеросклеротических изменений общей сонной артерии с двух сторон; диаметр и скорость кровотока по правой плечевой артерии (в фазу диастолы) в покое, затем сразу после снятия манжеты после 5-

минутной окклюзии плечевой артерии (с помощью манжеты, наложенной на плечо, в которой создавалось давление до 200 мм рт ст) и, в дальнейшем, через каждые 30 секунд в течение 5 минут. Эндотелий-зависимая вазодилатация (ЭЗВД) считалась нормальной, если при пробе с реактивной гиперемией диаметр и скорость кровотока по плечевой артерии увеличивались на 10% и более от исходных показателей. Также в рамках оценки ЭЗВД оценивалась скорость восстановления плечевой артерии к исходным параметрам в течение 5 минут.

Были оценены результаты магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного и/или спинного мозга с контрастированием (в качестве контрастного

54

вещества использовались Магневист и Гадовист), оценивались локализация,

размер, количество очагов в Т1, Т2, FLAIR, параметры накопления контраста очагами сразу после введения контрастного вещества и при отсроченном контрастировании через 30-40 минут. МРТ с контрастированием является общепринятым методом исследования при РС. Накопление контраста свидетельствует о несостоятельности гематоэнцефалического барьера и является маркером активности заболевания. У 34 пациентов МРТ исследование проводилось в пределах 1 месяца от момента исследования крови, у 22

пациентов – в пределах от 1 до 3 месяцев. Исследование проводилось на высокопольном магнитно-резонансном томографе фирмы Siemens с магнитной индукцией 1,5 Тесла.

2.4 Методы оценки лабораторных показателей.

Исследование лабораторных показателей (С-реактивный белок, фактор Фон Виллебранда, молекулы адгезии, матриксная металлопротеиназа-9)

проводилось в клинической лаборатории диагностического центра ЯОДКБ.

Исследование крови для подсчета количества десквамированных эндотелиоцитов по методу J.Hladovec (1978) проводилось на базе кафедры пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО ЯГМУ.

Забор крови для анализа проводился в первой половине дня, натощак.

Объем исследования включал анализ сыворотки крови на С-реактивный белок (СРБ); на содержание молекул адгезии sICAM-1, sPECAM-1, sE-selectin, sP-selectin, на содержание матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9);

исследование плазмы крови на антиген фактора Фон Виллебранда (vWf).

33 пациентам (15 пациентов с РРС, 8 с ВПРС, 9 с ППРС) было выполнено исследование крови для подсчета количества десквамированных эндотелиоцитов с использованием камеры Горяева по методу J.Hladovec (1978).

55

2.4.1.С-реактивный белок.

Вклинической практике для оценки эндотелиальной дисфункции особое значение придают определению концентрации высокочувствительного С–

реактивного белка (СРБ) [67]. Он синтезируется в печени, является представителем семейства белков острой фазы воспаления, его синтез регулируется провоспалительными цитокинами: интерлейкином–1,

интерлейкином–6, фактором некроза опухоли [36, 102]. Патологическое действие СРБ реализуется также в сочетании с другими медиаторами воспаления, особенно с интерлейкином–6, являющимся основным индуктором синтеза СРБ [126]. Для определения концентрации СРБ использовался высокочувствительный иммунотурбидиметрический метод с использованием реагентов «Beckman Coulter» на анализаторе «AU480 Beckman Coulter» в

полном соответствии с инструкциями к набору. Принцип метода заключен в следующем: С-реактивный белок формирует иммунные комплексы с соответствующими антителами, образуется мутная суспензия, оптическая плотность которой измеряется фотометрически; величина оптической плотности зависит от содержания CРБ в пробе; реакция производится методом

«по конечной точке» с холостой пробой по образцу, концентрация определяется по нелинейной калибровочной кривой. Уровни СРБ выражали в мг/л,

референтными значениями (в соответствии с инструкцией) считали 0 - 5 мг/л.

2.4.2 Молекулы адгезии.

Как уже отмечалось ранее, ключевым этапом в патогенезе РС является проникновение активированных лейкоцитов из циркулирующей крови через стенку сосуда (эндотелий) в ткань мозга. Взаимодействие лейкоцитов с эндотелием происходит посредством молекул адгезии, которые представлены как на эндотелиоцитах, так и на лейкоцитах. Основным регулятором процесса адгезии лейкоцитов является сам эндотелий.

56

Наиболее значимыми для патогенеза РС являются молекулы адгезии ICAM- 1 (Inter-Cellular Adhesion Molecule 1, CD54), РЕСАМ-1 (Platelet/Endothelial Cell Adhesion Molecule 1, CD31), VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule 1, CD106)

в дебюте и обострении РС.

Экспрессия ICAM-1 повышается на эндотелиальных клетках мозга под воздействием воспалительных медиаторов типа интерлейкин-1, фактор некроза опухоли и интерферон-γ, а его экспрессия коррелирует с инфильтрацией лейкоцитов в область воспаления. sICAM-1 – надежный маркер воспаления ЦНС, связанного с нарушением гематоэнцефалического барьера. Показано, что экспрессия ICAM-1 повышена в эндотелии капилляров у больных РС и при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ), и снижается в ответ на терапию бета-интерфероном [108]. В некоторых исследованиях показан протективный эффект блокирования активности ICAM-1 на развитие ЭАЭ.

РЕСАМ-1 экспрессируется в клетках сосудов, также обнаружен в тромбоцитах, моноцитах, нейтрофилах и CD8+ T-клетках. Подтверждена роль РЕСАМ-1 в воспалительных процессах и взаимодействии лейкоцитов с эндотелием [39, 158]. Исследования показывают повышение уровня РЕСАМ-1 в

ликворе и в крови у пациентов с РС, особенно в стадии обострения процесса, и

связь с гадолиний-накапливающими очагами на МРТ с контрастированием [90,

128].

Селектины представляют собой семейство Са-зависимых белков,

экспрессирующихся на эндотелиальных клетках (Е-селектин, CD62E, ELAM-1),

лейкоцитах (L-селектин, CD62L, LECAM-1), и тромбоцитах (Р-селектин,

CD62P, GMP-140). Е- и Р-селектины экспрессируются в ответ на воспалительные стимулы. Они опосредуют первоначальные слабые взаимодействия и способствуют прохождению лейкоцитов через эндотелий.

57

Р-селектин расположен в мембранах гранул нестимулированных тромбоцитов и оказывается на поверхности в результате их активации. Также он представлен в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах. Физиологическая роль его заключается в опосредовании адгезии лейкоцитов к активированному эндотелию в процессе воспаления [89].

E-селектин экспрессируется на цитокин-активированных эндотелиальных клетках и участвует в адгезии еще неактивированных лейкоцитов к эндотелию.

Это начальное связывание является необходимой предпосылкой для активации иммунных клеток воспалительными медиаторами [101].

Исследования показали повышение уровня растворимых форм L-,P-, и E-

селектинов в кровотоке и спинномозговой жидкости у больных РС с некоторым вариациями в зависимости от формы заболевания и стадии процесса [74, 97, 142, 154].

Анализ сыворотки крови на растворимые формы молекул адгезии (sICAM – 1, sPECAM – 1, sE-selectin, sP-selectin) проводился методом иммуноферментного анализа с использованием реагентов «Bender MedSystems»

с использованием микропланшетного фотометра «Anthos 2020». Во всех случаях следовали инструкциям производителей наборов. Уровни всех показателей выражали в нг/мл.

ММР могут оказывать многостороннее влияние на развитие РС, включая участие в разрушении ГЭБ, активацию проформ цитотоксических молекул,

прямое разрушение миелина и образование продуктов расщепления, способных вызвать аутоиммунный ответ.

58

Уровни ММР-9 и/или соотношение ММР-9 и ее ингибитора -TIMP-1,

повышены в кровотоке у больных ремиттирующим РС и вторично прогрессирующим РС, а также коррелируют с наличием «активных» очагов на МРТ. Источником ММР-9 могут являться клетки различных типов – макрофаги, микроглия, астроциты, эндотелиальные клетки, инфильтрирующие лимфоциты в области демиелинизации. Во многих исследованиях показана корреляция между проводимой при РС терапией и изменением уровня ММР-9

или его ингибиторов. Многочисленные исследования ЭАЭ подтверждают ведущую роль ММР-9 в патогенезе РС [37, 65, 151, 160, 174].

Анализ сыворотки крови на матриксную металлопротеиназу – 9 (ММР-9)

проводился методом иммуноферментного анализа с использованием реагентов

«Bender MedSystems» с использованием микропланшетного фотометра «Anthos

2020». Анализ проводился в полном соответствии с инструкцией производителя набороа. Уровень показателя выражали в нг/мл.

2.4.4 Фактор Фон Виллебранда.

Фактор Фон Виллебранда (vWF) – сложный мультимерный адгезивный гликопротеин, синтезируемый эндотелиальными клетками и мегакариоцитами.

Повышенные уровни vWF являются индикатором повреждения эндотелия. При многих заболеваниях, сопровождающихся острым и хроническим повреждением эндотелия, уровень vWF в крови значительно повышается [25, 38]. Немногочисленные проведенные исследования показали повышение vWF

на моделях ЭАЭ и у пациентов с рассеянным склерозом, а также возможную его связь с активностью процесса и лечением заболевания [81, 96, 129].

Анализ плазмы крови на антиген фактора Фон Виллебранда (vWF)

производился методом иммуноферментного анализа с использованием реагентов фирмы «Technoclone» и микропланшетного фотометра «Anthos

2020», во всех случаях следовали инструкциям производителей наборов.

59

Уровни показателя выражали в Ед/мл, референтными значениями (в

соответствиями с рекомендациями к набору) считали 0,5-1,5 Ед/мл.

2.4.5 Десквамированные эндотелиоциты.

Одним из важных маркеров повреждения эндотелия является определение количества циркулирующих в крови эндотелиальных клеток -

десквамированных эндотелиоцитов [156].

Изменение концентрации десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови связано с вовлечением в патологический процесс эндотелия и усилением десквамации эндотелиальных клеток в результате повреждения эндотелия [16, 47, 62, 80].

Для определения количества десквамированных эндотелиоцитов использовался метод J.Hladovec (1978): к 5 мл цельной крови добавлялся цитрат натрия 0,5 мл, затем кровь центрифугитровалась 240 g (1000 оборотов в минуту) в течение 10 минут. В полученную таким образом богатую тромбоцитами плазму (1мл) добавлялся 0,2 мл АДФ в концентрации 1 мг/мл и

10 минут покачивая в руках ожидали агрегацию тромбоцитов. Надосадочную жидкость сливали в другую пробирку, центрифугировали ее на скорости 1000

оборотов в минуту в течение 10 минут. После чего получившуюся надосадочную жидкость вновь перемещали в другую пробирку и центрифугировали на скорости 3000 оборотов в минуту в течение 15 минут.

Далее надосадочную жидкость сливали, а остаток суспензировали в 0,1 мл физиологического раствора, тщательно перемешивая палочкой. Затем заполняли получившимся остатком камеру Горяева и производилли подсчет клеток в 2 сетках, результат умножали на 104, в результате чего получали количество клеток в 1 литре. Уровни показателя выражали в количестве обнаруженных эндотелиоцитов х 104/л, референтными значениями считали 0-2

х104/л [80].

60

3. Статистическая обработка материала.

Результаты исследования заносились в специально созданную базу данных и обрабатывались с помощью программ анализа данных Microsoft Exсel 2010

(описательная статистика) и программы Statistica 10. Критический уровень значимости составлял p<0,05. Описательная статистика была представлена в виде среднего значения, стандартной ошибки среднего, медианы, моды и квартильного интервала, описательная статистика качественных признаков - в

виде абсолютных и относительных частот (процентов). Для сравнения 2

независимых групп по одному признаку применялся U-критерий Манна-Уитни,

критерий Колмогорова-Смирнова, для сравнения более 2 групп по одному признаку применялся критерий Краскелла-Уоллеса. Для сравнения одной и той же группы пациентов в динамике использовались критерий Вилкоксона и знаковый тест (Sign Test). Для оценки влияния независимых переменных на зависимую применялся регрессионный анализ. Для выявления взаимосвязи двух признаков применялся непараметрический корреляционный анализ по Спирмену (для выявления корреляций уровня лабораторных показателей со стадией заболевания использовалась кодировка: 1 – стадия ремиссии и стабилизации, 2 – стадия обострения, 3 – стадия прогрессирования; для выявления корреляций уровня лабораторных показателей с типом течения заболевания использовалась кодировка: 1 – ремиттирующий тип течения, 2 –

вторично-прогрессирующий тип течения, 3 – первично-прогрессирующий тип течения).