диссертации / 85

61

сравнения средних значений применяли критерий Стьюдента, при отличии распределения от нормального – критерий Манна-Уитни. Для оценки корреляционной связи между признаками использовали метод ранговой корреляции Спирмена. Для выявления характеристик потенциального маркера использовали ROC-анализ. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимали р=0,05.

62

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение фармакологических свойств новых синтетических лигандов рецепторов прогестерона

Лиганды рецепторов прогестерона широко применяют при лечении гипер- и

неопластических процессов гормон-чувствительных тканей, что делает поиск новых гестагенов/антигестагенов перспективным направлением повышения эффективности консервативной терапии. Одними из таких синтетических лигандов рецепторов прогестерона являются прегна-D´-пентараны (D´6).

Изучение кинетики прямого и конкурентного взаимодействия меченых прогестерона и пентаранов с рецепторами показало, что рецепторы прогестерона является единственным общим для них центром специфического связывания [8],

поэтому препаратом сравнения был выбран прогестерон. Ранее было показано,

что концентрация прогестерона в ткани мишени при применении в терапевтических дозах обычно составляет 18 нг/мл в ткани эндометрия [75],

поэтому в качестве достаточной дозы для соединений была принята концентрация

10-8 M.

Поскольку известно, что развитие гиперпластических процессов тесно связано с изменениями функции иммунной системы, необходимо анализировать влияние аналогов прогестерона на опухолевые и иммунокомпетентные клетки.

3.1. Определение специфического связывания прегна-D’-пентаранов с

прогестерон-связывающими участками клеток мононуклеарной фракции

периферической крови

Удобным и доступным объектом для анализа связывания исследуемых соединений с рецепторами прогестерона является мононуклеарная фракция периферической крови, которая содержит рецепторы прогестерона и является подробно изученной и воспроизводимой моделью. Известно, что у женщин репродуктивного периода уровень прогестерона в крови выше по сравнению с

63

пре- и постменопаузальным возрастом, поэтому оценка общего и специфического связывания лигандов рецепторов прогестерона проводилась на МНФК периферической крови пациенток репродуктивного возраста.

Для определения количества прогестерон-связывающих участков в МНФК было проведено 9 последовательных экспериментов, в результате которых их число составило 347 ± 171 фемтомоль/млн. клеток.

Полученные нами данные отражают суммарное специфическое связывание

3Н-прогестерона с МНФК. Специфически связывать прогестерон в клетках могут классические внутриклеточные рецепторы, относящиеся к суперсемейству NR3C3,

а также плазмамембранные рецепторы mPR, PGRmC1 и сигма-рецепторы.

Специфическое связывание 8 прегна-D’-пентаранов оценивали по конкурентному вытеснению эндогенного лиганда из связи с рецепторами прогестерона, т.е. анализировали способность 200-кратного избытка прегна-D’-

пентаранов вытеснять меченый тритием прогестерон из его связи с рецепторами

(вытеснение 3Н-прогестерона 200-кратным избытком немеченого прогестерона принимали за 100%). Полученные нами результаты специфической связывающей активности изучаемых соединений с клетками МНФ периферической крови представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Уровни специфического связывания прегна-D’-пентаранов с прогестерон-связывающими участками в мононуклеарах периферической крови женщин репродуктивного возраста (М ± SE, в процентах от связывания

3Н-прогестерона, значение которого принимаем за 100%).

64

Примечание: р – достоверность отличия значения от контрольных показателей.

Согласно нашему исследованию, практически все исследуемые соединения обладают достаточно высоким сродством к рецепторам прогестерона, за исключением прегна-D’-пентарана К-1030 (p=0,049).

Согласно исследованию, специфические связывающие активности соединений, используемых для терапии гиперпластических процессов, с

рецепторами прогестерона составляют: для прогестерона – 50%,

медроксипрогестерона ацетата115%, левоноргестрел – 150%, норэтистерон

(норэтиндрон) – 75% [96]. Таким образом, сравнивая специфическое связывание с рецепторами прогестерона прегна- D’-пентаранов по сравнению с использующимися в клинической практике препаратами, можно предположить,

что исследуемые соединения являются перспективными соединениями для дальнейшей терапии гиперпластических процессов слизистой оболочки матки.

Однако, связывание стероидов с рецепторами не может служить единственной тест-системой в отборе активных препаратов, так как соединения могут проявлять различную эффективность при условии высокого аффинитета к рецепторам прогестерона. Поэтому рецепторный анализ всегда сочетают с изучением влияния препаратов на функционирование клеток-мишеней, в

65

частности, на жизнеспособность и специфическую функцию клеток (например,

цитокинопродукцию).

3.2. Анализ влияния прегна-D’-пентаранов на уровень продукции

ФНО-α мононуклеарной фракцией периферической крови

Для оценки влияния лигандов рецепторов прогестерона на функциональную активность мононуклеаров периферической крови нами было проведено исследование влияния прегна-D’-пентаранов на уровень продукции провоспалительного цитокина ФНО-α. ФНО-α - это регулятор иммунной и воспалительной реакций, который проявляет избирательную цитотоксичность в отношении опухолевых клеток.

Согласно классической фармакологической схеме, определение действия соединения осуществляется путем сравнения эффектов исследуемых веществ с эффектом известного агониста, поэтому в качестве вещества сравнения нами был выбран прогестерон.

Было проведено 6 последовательных экспериментов, при инкубации МНФК использовались 8 пентаранов и прогестерон. За 100% принимали цитокинопродукцию клеток, инкубированных без соединений (контроль).

Результаты экспериментов представлены на диаграмме 2.

Диаграмма 2.

Концентрация ФНО-α в МНФК при инкубации с прегна-D'-

пентаранами (М ± SE, в % от значений контрольных групп, концентрация соединений - 10-8М, длительность инкубации – 72 ч.).

66

Примечание: - значение статистически достоверно отличается от контроля (р<0,05).

Из приведенных на диаграмме 6 данных видно, что прегна-D’-пентараны К-

338, К-1036 и К-1045 снижают выработку мононуклеарами ФНО-α на 11%, 10% и

20% (p=0,023, p=0,014, p=0,023), соответственно, тогда как соединение К-1044 –

увеличивает ее на 11% (p=0,014) по сравнению с контролем. При этом все остальные соединения не показали значимого влияния на цитокинопродукцию МНФК.

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) -провоспалительный цитокин,

который в периферической крови выделяется преимущественно моноцитами и лимфоцитами. TNF-α увеличивает в других клетках продукцию интерлейкинов

IL-1 и IL-6, стимулирует адгезию и индукцию апоптоза измененных клеток,

продукцию колониеобразующих факторов эндотелиальными клетками и фибробластами, которые участвуют в процессе ангиогенеза. Кроме того, он активирует антителопродукцию В клетками, осуществляет костимуляцию активации Т-лимфоцитов и NK-клеток, повышает продукцию IFN-γ Т-клетками и

67

IL-8 нейтрофилами, а также обладает общим цитотоксическим действием по отношению к опухолевым клеткам [23]. Таким образом, этот цитокин, благодаря своему действию на иммунную систему, играет важную роль в патогенезе хронических воспалительных заболеваний и в регуляции неопластической трансформации.

Известно, что полипы эндометрия часто сочетаются с воспалительными процессами слизистой матки, и для их терапии актуальны препараты,

обладающие помимо антипролиферативного еще и противовоспалительным эффектом [14]. Поэтому можно предположить, что соединения К-338, К-1036 и К-

1045имеют дополнительное преимущество при лечении полипов эндометрия, а

соединение К-1044 перспективно при терапии опухолей, поскольку стимулирует продукцию противоопухолевого цитокина.

3.3.Влияние прегна-D’-пентаранов на жизнеспособность неизмененных

иопухолевых гормон-чувствительных клеток

Использование гестагенов в клинической практике, в частности, в

онкогинекологии, часто преследует цель – подавление жизнеспособности гормонозависимых патологически измененных клеток, поэтому исследуемые соединения должны обладать потенциальным токсическим эффектом по отношению к патологическим клеткам. Однако, поскольку препараты оказывают системный эффект, сначала необходимо оценить цитотоксичность лигандов рецепторов прогестерона по отношению к неизмененным клеткам крови – МНФК.

Для выяснения способности новых стероидных соединений влиять на жизнеспособность клеток нами использовался МТТ-тест, который в настоящее время широко применяется в лабораторных и экспериментальных исследованиях для определения жизнеспособности клеток [5].

69

Таким образом, исследуемые соединения, включая прогестерон, не оказывают значимого эффекта на жизнеспособность мононуклеарных клеток периферической крови больных как с неизмененным эндометрием, так и с полипами эндометрия по сравнению с контролем, т.е. изучаемые прегна-D’-

пентараны не оказывают значимого отрицательного влияния на жизнеспособность иммунокомпетентных клеток крови.

При этом необходимо отметить, что жизнеспособность клеток мононуклеарной фракции под действием исследуемых лигандов рецепторов прогестерона зависела от возраста пациенток (диаграмма 3).

Диаграмма 3.

Уровни жизнеспособности клеток мононуклеарной фракции периферической крови пациенток репродуктивного и постменопаузального возраста после инкубации с прегна–D’-пентаранами и прогестероном по сравнению с контролем (M+SE, % от контроля, концентрация соединений - 10- 8М, длительность инкубации – 72 ч).

Как видно из диаграммы 3, у пациенток постменопаузального возраста без гинекологических патологий жизнеспособность МНФК под действием прогестерона, К-1030, К-1039, К-1036, К-1045 (p=0,048, р=0,024, р=0,012, р=0,012,

р=0,012, соответственно) была выше, чем у больных репродуктивного возраста.

Это может быть связано, с одной стороны, с уменьшением прогестерон-

зависимого подавления пролиферативной и функциональной активностью лимфоцитов в постменопаузальном возрасте за счет прекращения работы яичников после наступления менопаузы [1, 25]. С другой стороны, данный эффект может быть обусловлен снижением уровня рецепторов эстрадиола в моноцитах после наступления менопаузы, что, в свою очередь, приводит к снижению экспрессии рецепторов прогестерона [37].