диссертации / 85

51

Схема 1.

Последовательность экспериментов по оценке влияния лигандов рецепторов прогестерона на мононуклеарную фракцию клеток периферической крови.

ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ КРОВЬ

СЕДИМЕНТАЦИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ ФИКОЛЛА

МОНОНУКЛЕАРНАЯ ФРАКЦИЯ КЛЕТОК

52

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение мононуклеарной фракции клеток из периферической

крови

Получение мононуклеаров из периферической крови осуществляли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла («ПанЭко», Россия) по

Boyum [38]. Кровь с гепарином (10 и 1 мл, соответственно) разводили физиологическим раствором в объемном соотношении 1 : 1. Разведенную кровь по 5 мл наслаивали на 3 мл раствора фиколла комнатной температуры (ρ=1,077

г/см3) в полистирольной центрифужной пробирке на 10 мл и центрифугировали

45 мин при 2000 об/мин и 4 0С на приборе РС-6 («ТНК Дастан», Киргизия). Затем автоматическим дозатором отбирали фракцию мононуклеарных клеток,

находящуюся на границе плотности (рисунок 6), переносили ее в чистую центрифужную пробирку и доводили объем физиологическим раствором до 10

мл.

Рисунок 6.

Разделение форменных элементов крови в градиенте плотности

фиколла.

53

Примечание: 1 – плазма крови, 2 – слой мононуклеарных клеток, 3 –

фиколл, 4 – эритроциты.

Далее полученную взвесь центрифугировали 15 мин при 1600 об/мин и 4 0С

(РС-6), сливали супернатант и доводили объем физиологическим раствором до 10

мл, снова центрифугировали 15 мин при 1600 об/мин и 4 0С и сливали надосадочную жидкость. Оставшийся осадок (МНФК) использовали для анализа.

Подсчет и анализ жизнеспособности клеток производили в камере Горяева под микроскопом Биолам П2-1(«ЛОМО», Россия) в среде DMEM («ПанЭко», Россия)

спомощью красителя трипанового синего («ПанЭко», Россия).

2.2.2.Определение специфического связывания 3Н-прогестерона с прогестерон-связывающими участками МНФК периферической крови

Изучение специфического связывания прогестерона в мононуклеарной фракции проводили с помощью конкурентного радиолигандного анализа [2].Для определения общего связывания пробы содержали 20 нМ [1,2,6,7]-3Н-Р4 («GE Healthcare Ltd», Англия) и 1мкМ гидрокортизона («Merck», Германия) в

инкубационной среде. Для определения неспецифического связывания пробы дополнительно содержали 2 мкМ прогестерона («Merck», Германия). Этанол,

используемый для разведения стероидов, после раскапывания в 96-луночный планшет, испаряли. Затем добавляли по 100 мкл мононуклеарной фракции клеток крови (~ 1 млн. клеток/лунка) в среде DMEM («ПанЭко», Россия), инкубировали

60 мин при 37 0С, после чего клеточную суспензию из каждой лунки с помощью автоматического дозатора помещали на стеклянные фильтры Whatman GF/B («GE Healthcare Ltd», GB) и промывали 100-кратным избытком ледяного ТЭД-буфера

(10 мМ TRIS («Merck», Германия), 1,5 мМ ЭДТА («Sigma», США), 0,5 мМ дитиотрейтол («Calbiochem», Англия), 10% глицерина («ПанЭко», Россия), pH=7,4). Стеклянный фильтр из каждой пробы после высушивания помещали во

54

флаконы с 10 мл сцинтилляционной жидкости Ultima Gold AB («PerkinElmer»,

США).

Все исследования проводили в триплетах. Связывание стероидных гормонов в МНФК выражали в фемтомолях гормона на млн. клеток, которое рассчитывали по формуле:

N = ( T – NSB ) / ( K * С )

Примечание: N – количество рецепторов прогестерона (фмоль на 1млн.

клеток); Т - средняя величина общего (в отсутствии конкурента) связывания меченого гормона в dpm (decompositions per min, распад в минуту); NSB- средняя величина неспецифического (в присутствии конкурента) связывания в аналогичной аликвоте в dpm, регистрируемых β-радиометром; K – коэффициент пересчета количества связанного гормона из dpm в фмоль, зависящий от удельной радиоактивности 3Н-прогестерона; С – концентрация клеток в лунке (100 мкл).

2.2.3. Определение специфического связывания синтетических

стероидов с рецепторами прогестерона

Исследование специфического связывания прегна-D’-пентаранов с прогестерон-связывающими участками МНФ проводили аналогично определению специфического связывания прогестерона с рецепторами прогестерона, но вместо избытка немеченого прогестерона в лунки планшета вносили по 2 мкМ образцов прегна-D’пентаранов. Величину специфического связывания лигандов рецепторов прогестерона (% ингибирования специфического связывания Н3-

прогестерона веществом) оценивали согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [27] по формуле:

И= (В спец. преп./В спец. горм.)*100%, где

55

И – ингибирование специфического связывания с рецептором 3Н-

прогестерона препаратом, В спец. преп. – специфическое связывание прогестерона в присутствии препарата; В спец. горм. – специфическое

связывание прогестерона в отсутствии препарата.

2.2.4. Жидкостная сцинтилляционная радиометрия

Воснове метода лежит свойство β-частиц вызывать сцинтилляцию веществ

вспециальных средах. Это дает возможность с большой эффективностью регистрировать β-излучение, обладающее малой энергией. Для регистрации радиоактивности образцы с меченым тритием прогестероном помещали во флаконы с 10 мл сцинтилляционной жидкости Ultima Gold AB («PerkinElmer»,

США). Смесь перемешивали и регистрировали радиоактивность образца на жидкостном сцинтилляционном альфа-бета радиометре «Tri-carb 3110» («PerkinElmer», США). Эффективность счета для 3Н составила 64-68%.

2.2.5. Инкубация клеток с прегна-D’-пентаранами и прогестероном.

Работу с клетками осуществляли в стерильных условиях – в ламинарном боксе («LS», Россия).

Cпиртовые растворы прегна-D’-пентаранов и прогестерона вносили во все лунки стерильного плоскодонного 96-луночного планшета, кроме лунок контроля так, чтобы их конечная концентрация в инкубационной среде составила 10-8 М.

Этанол после раскапывания испаряли. Затем в лунки планшета добавляли по 200

мкл суспензии клеток в полной среде DMEM (среда DMEM (100 мкг/мл L-

глутамина и 40 мкг/мл гентамицина сульфата) («ПанЭко», Россия) с 20 %

термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко»,

Россия)), количество клеток в лунке составляло 0,1-0,5 млн. клеток. Клетки инкубировали в термостате ТС-80М («МЕДЛАБОРТЕХНИКА», СССР) при 37ºС в условиях 5% СО2, во влажной среде для исключения высыхания, в течение 3-х

56

суток. После инкубации отбирали автоматической пипеткой 100 мкл супернатанта для определения концентрации ФНО-альфа в супернатанте, оставшиеся клетки использовали для постановки МТТ-теста и выделения мРНК.

2.2.6. Оценка метаболической активности клеток (МТТ-тест)

Оценку жизнеспособности клеток проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [27]. Метод основан на способности ферментов дыхательной цепи митохондрий (сукцинатдегидрогеназ) живых клеток восстанавливать бледно-

желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в воде.

Количество образовавшегося формазана характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в клетках, то есть их жизнеспособность.

После завершения инкубации клеток с соединениями к 100 мкл суспензии клеток добавляли по 10 мкл МТТ-раствора (концентрация МТТ («Sigma», США)

составляла 10 мг/мл), приготовленного на среде DMEM («ПанЭко», Россия).

Затем планшеты с клетками инкубировали в термостате в течение 3 ч при 37 0С, 5% СО2. После инкубации супернатант из лунок аккуратно отбирали шприцом и вносили в каждую лунку планшета по 100 мкл ДМСО (диметилсульфоксида) («Serva», Германия), перемешивали 30 мин для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Развитие окраски регистрировали с помощью определения оптической плотности при λ=530 нм на планшетном фотометре «Униплан» АИФР-01 («Пикон», Россия). Оптическую плотность контрольных образцов, в

отсутствие исследуемых соединений, принимали за 100% жизнеспособность клеток. Погрешность измерения составила ±0,007%.

57

2.2.7. Определение уровня ФНО-α иммуноферментным анализом

Для анализа концентрации цитокина отбирали по 100 мкл супернатанта из каждой лунки планшета по окончании инкубации c веществами (п. 2.2.5.)

Иммуноферментный анализ проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору готовых реагентов альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ («Вектор-БЕСТ», Россия).

Регистрацию результатов проводили с помощью планшетного фотометра

«Униплан» АИФР-01 («Пикон», Россия) при длине волны 450 нм. Погрешность измерения составила ±0,008%.

2.2.8. Выделение мРНК из клинического материала

Выделение РНК из клеток МНФК периферической крови проводили методом преципитации с помощью набора готовых реагентов "Рибо-преп" (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.

2.2.9. Реакция обратной транскрипции для получения кДНК

Получение кДНК на матрице мРНК осуществляли реакцией обратной транскрипции с использованием комплекта готовых реагентов "Реверта-L" (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.

2.2.10. Полимеразная цепная реакция в реальном времени для

определения уровня экспрессии генов

Для реакции использовали набор реактивов для ПЦР "Реакционная смесь

2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I" («Синтол», Россия) на

58

приборе iCycler iQ 5 real-time PCR («BioRad», Германия). В качестве

контрольного гена использовали ген GAPDH.

Для постановки 12 реакций с праймерами для одного гена в 1,5 мл микроцентрифужные пробирки добавляли 117 мкл H2Oдд, 117 мкл MIX-смеси, 13

мкл MgCl2, перемешивали и отбирали 19 мкл полученной смеси в 200 мкл микропробирки для первого контроля. Затем в полученную смесь вносили по 24

мкл прямого и обратного праймеров (up и low), перемешивали и отбирали 23 мкл полученной смеси в 200 мкл микропробирки для второго контроля.

Последовательности нуклеотидов в используемых праймерах представлены в

таблице 6 («Синтол», Россия).

Таблица 6.

Последовательности нуклеотидов (5’-3’ последовательности) в

праймерах для определения экспрессии генов мембранных и ядерных

рецепторов прогестерона и эстрадиола.

Примечание: ген сравнения – GAPDH (глицеральдегид-

фосфатдегидрогеназа); mER – мембранные рецепторы эстрадиола, ERαи ERβ–

ядерные рецепторы эстрадиола, mPR и PGRmC1 – мембранные рецепторы прогестерона, PR-Аи PR-В – ядерные рецепторы прогестерона.

60

Рисунок 8.

Кривые плавления продуктов амплификации на примере генов Gapdh,

mER, PR-A.

Для оценки числа копий мРНК применяли Сt-метод по формуле 1/2-∆Ct

(для выявления различий) и 2-∆∆Ct (для определения кратности разницы), где Ct –

пороговый цикл (threshold cycle), соответствующий числу циклов амплификации,

необходимых для достижения порогового значения флуоресценции, ∆Сt – разница между пороговым циклом исследуемого гена и геном сравнения (GAPDH), ∆∆Сt –

сравнение значений ΔCt контрольного и опытного образцов [89].

2.2.11. Статистическая обработка результатов

Все данные исследования обрабатывали с использованием программ

Microsoft Office Excel 2007 и GraphPad Prism 5.0. Результаты представили в виде среднего значения (М) и стандартной ошибки (SE).

Для проверки гипотезы о принадлежности наблюдаемой выборки нормальному закону распределения использовали критерий Колмогорова-

Смирнова. При параметрическом распределении изучаемых параметров для