диссертации / 85

11

более 0,314 (по формуле 0,5-ΔCt*100 относительно гена GAPDH) может свидетельствовать о развитии гиперпластических процессов слизистой оболочки матки у пациенток старшей возрастной группы.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

Исследуемые представители гомологического ряда прегна-D’-пентаранов обладают достаточно высокой специфической связывающей активностью в отношении прогестерон-связывающих участков клеток мононуклеарной фракции периферической крови, по-разному влияют на цитокинопродукцию мононуклеарами периферической крови, способны подавлять жизнеспособность культур опухолевых клеток, при этом не оказывая цитотоксического действия на фракцию мононуклеарных клеток периферической крови, и влияют на стероидно-

рецепторный транскриптом МНФК у пациенток с гиперпластическими процессами эндометрия по сравнению с женщинами без гинекологической патологии.

Апробация работы: состоялась на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева МБФ, аспирантов и сотрудников научно-исследовательской лаборатории молекулярной фармакологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова № 10 от 10 декабря 2013 г.

Публикации

Материалы работы доложены и обсуждены на X Всероссийской научной конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2011), Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины 2012» (Харьков,

2012), XXV Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2012), IV

съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань,

2012), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2013), VIII Международной (XVIII

12

Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию методов исследования, изложению результатов работы и их обсуждению, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 111

источников. Работа изложена на 119 страницах, иллюстрирована 8 рисунками,

содержит 22 таблицы, 15 диаграмм и 1 схему.

13

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ДЕЙСТВИЕ ЛИГАНДОВ РЕЦЕПТОРОВ ПРОГЕСТЕРОНА НА КЛЕТКИ МОНОНУКЛЕАРНОЙ ФРАКЦИИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

ПРИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ЭНДОМЕТРИЯ

1.1.Лиганды рецепторов прогестерона

Прогестерон (прегн-4-ен-3,20-дион) представляет собой стероидный гормон с молекулярной массой 314,5 дальтон. Прогестерон является гормоном сохранения беременности, участвует в созревании яйцеклетки, дифференцировке эндометрия, имплантации эмбриона, росте плаценты, предотвращении сокращения миометрия, дифференцировке тканей молочной железы. Кроме того,

он необходим и для нормального функционирования различных систем организма: обладает нейропротекторным и нейрорегенеративным эффектами,

играет важную роль в функционировании иммунной системы [53].

Синтезировано большое число производных прогестерона и изучена их способность влиять на ткани-мишени: матку, яичники и молочные железы, а

также на другие органы и системы [20].

Гестагены – группа соединений, проявляющих гестагенную активность,

проявляющуюся в изменении секреторной трансформации эндометрия у инфантильных кроликов (тест Клауберга-МакФейла). Они включают в себя вещества как натурального, так и синтетического происхождения (таблица 1,

рисунок 1).

Таблица 1.

Классификация прогестагенов на основании их химической структуры

(по [96]).

15

Для связывания с рецепторами прогестерона необходимо наличие неароматического кольца А (с кетогруппой в положении 3 и двойной связью между атомами С4 и С5) в инвертированной конформации 1β, 2α, при которой атом С1 находится над, а С2 – под плоскостью, проходящей через атомы С3 – С5 и

С10. Другие рецепторы стероидных гормонов также связываются с таким неароматическим кольцом А, но для обеспечения с ними высокого сродства конформация кольца А должна быть иной.

Биологическая активность гестагенов зависит от их химической структуры.

Это обусловлено тем, что свойства соединений зависят от взаимодействия стероидной молекулы с определёнными участками лиганд-связывающего домена

(ligand binding domain, LBD) рецептора прогестерона (рисунок 2) [102].

Рисунок 2.

Взаимодействие молекулы прогестерона с аминокислотами лиганд-

связывающего домена рецептора прогестерона [102].

Примечание: Gln – глутамин, Arg – аргинин, Phe – фенилаланин, W – Ван-

дер-Ваальсово взаимодействие между молекулами, числовые обозначения – в Ангстремах (10−10 м).

16

Важную роль в прогестерон-связывающем кармане играют следующие молекулы: остаток аргинина 766 необходим для правильной ориентации молекулы прогестерона через водородные связи относительно остатка глутамина

725, при этом фенилаланин фиксирует А-кольцо стероида через Ван-дер-

Ваальсову связь [102]. При этом другие остатки аминокислот также взаимодействуют с молекулой лиганда, что приводит, в конечном итоге, к

проявлению агонистической или антагонистической активности [68].

Так, добавление к молекуле прогестерона гидроксильной группы у 17 атома углерода лишает прогестерон гестагенной активности, а ацетилирование по этой гидроксильной группе увеличивает гестагенную активность, а при добавлении метильной группы к 6 атому углерода активность соединения также может увеличиться [96].

Введение в молекулу медроксипрогестерона ацетата двойной связи между атомами углерода 6 и 7, замещение метильной группы у 6 атома углерода, а также добавление метиленовой группы к 1 и 2 атому углерода повышает прогестагенную активность соединения [96].

Кроме того, изменение положения метильной группы у 10 атома углерода прогестерона с бета на альфа-положение, по-видимому, является причиной отсутствия способности соединения вызывать ингибирование овуляции в течение менструального цикла и изменения базальной температуры тела [96].

Введение в молекулу тестостерона этинильной группы в 17 альфа-

положение приводит к снижению андрогенной активности, а удаление метильной группы в 10 положении углерода повышает прогестагенные свойства и уменьшает андрогенные [96].

Таким образом, существуют литературные данные о влиянии разных заместителей в молекуле прогестерона на прогестагенную, андрогенную активность полученных веществ. При дальнейшем изменении молекул прогестерона могут появиться новые классы соединений, которые будут обладать другими свойствами. Создание таких классов позволяет более глубоко изучить

17

структурно-функциональные связи в ряду производных прогестерона и их свойства.

Химическая модификация молекулы прогестерона привела к созданию нового класса синтетических прогестинов - 16α,17α-циклоалканопрогестеронов

(прегна-D’-пентаранов), полученных в лаборатории химии стероидов и оксилипинов N 22 ИОХ им. Зелинского (зав. д.х.н. И.В. Заварзин) путем введения дополнительного карбоцикла в молекулу прогестерона, конденсированного со стероидным скелетом в 16α,17α-положениях (рисунок 3)[8].

Рисунок 3.

Структурная формула прегна-D’-пентаранов.

Примечание: X, Y, R1– положения заместителей.

Известно, что стероиды с заместителями в стероидном скелете могут обладать различными видами биологической активности (гормональной и негормональной) в зависимости от особенностей структуры и типа заместителей в стероидном скелете [55].

Прегна-D´n–пентараны - это класс 3,20-дикетопрегнанов с дополнительным

16α, 17α-карбоциклом, содержащим от трех до семи атомов углерода (индекс n-

указывает число атомов дополнительного карбоцикла D´), представители которого обладают прогестагенной или антипрогестагенной активностями in vivo.

18

Прогестерон несет две полярные нехиральные (3- и 20-карбонильные)

группы, и в силу своей общей изогнутости представляет большие возможности для стереохимических трансформаций [8].

Прегна-D´-пентараны, различающиеся только по размеру дополнительного карбоцикла, делятся в соответствии со своей активностью in vivo на три основные группы:

1)высокоактивные соединения (полные агонисты прогестерона);

2)соединения, активные в тесте трансформации эндометрия, но малоактивные в тесте сохранения беременности;

К первой группе полных агонистов прогестерона относится 16α, 17α –

циклогексанопрогестерон и его аналоги, несущие в 6α положении заместители и/или дополнительные двойные связи (∆1или ∆6) в стероидном скелете.

Соединения с трех-пятичленным дополнительным D´-циклом (вторая группа) характеризуются снижением гестагенной активности, в то время как наличие двойной связи в дополнительном шестичленном карбоцикле (третья группа) несколько увеличивает прогестагенную активность соединения [8].

По результатам исследований, активность прегна-D’-пентаранов по сохранению беременности в эксперименте варьирует от 0 до 100 %, в зависимости от заместителей [8]. Таким образом, среди высокоактивных гормоноподобных веществ ряда пентаранов были обнаружены соединения с высокой гестагенной активностью.

Таким образом, прегна-D’-пентараны являются высокоактивными соединениями с разделенными биологическими функциями в зависимости от модификаций их молекулы, что делает их перспективными для дальнейшего поиска соединений для применения в клинике в качестве активных гестагенов.

Как и у большинства стероидов, действие прогестерона и прегна-D’-

пентаранов на клетки-мишени опосредуется путем связывания и активации специфических клеточных рецепторов: ядерных («классических»,

внутриклеточных) и мембранных («неклассических»). Так, лигады рецепторов прогестерона способны как изменять траскрипцию генов-мишеней, так и

19

запускать инициированные через мембранные рецепторы сигнальные каскады

[25].

В 1998 г. сформулирована Маннхеймская классификация эффектов половых

стероидов с учетом их внегеномного действия [49]. Ее суть отражена в таблице 2:

Таблица 2.

Действие прогестерона на ткань-мишень ([49] с модификациями).

I. Неспецифические

(без рецептора, возможен эффект стероида на физические свойства плазматической мембраны)

II. Специфические

(рецептор и лиганд обязательны)

а) классический ядерный стероидный рецептор

в) неклассический (мембранный) стероидный рецептор

Первой структурой, с которой взаимодействуют стероидные гормоны в процессе реализации биологической активности на клеточном уровне, является цитоплазматическая мембрана клетки-мишени.

Еще в 1979 году академиком П.В. Сергеевым были опубликованы основные положения мембранорецепторной теории действия стероидных гормонов. В

соответствии с этой теорией:

1)стероид узнается плазматической мембраной клетки-мишени;

2)плазматическая мембрана связывает и осуществляет перенос лиганда в клетку, включает систему вторичных посредников;

3)в распознавании и транслокации гормона принимают участие мембраны субклеточных органелл;

20

4) в превращении химического гормонального сигнала в биологический ответ клетки-мишени первостепенное значение имеют процессы транскрипции и трансляции [21].

В настоящее время для всех классов стероидных гормонов доказано существование на плазматических мембранах клеток-мишеней специфических рецепторов, которые опосредуют быстрые, негеномные эффекты стероидов,

индуцируя изменения проницаемости мембраны для различных ионов, или изменяя активность ферментов, образование вторичных посредников внутри. За последнее время выделены, идентифицированы и описаны свойства нескольких плазмамембранных рецепторов прогестерона, наиболее важными из которых являются два варианта: mPR и PGRmC, которые оказывают независимые от транскрипции эффекты на клетки-мишени, в том числе и ткани матки и клетки иммунной системы [25, 65].

Рецепторы mPR относятся к семейству ассоциированных с G-белком, семь раз пронизывающих мембрану рецепторов прогестерона и адипонектина (PAGR) [105]. Различают три субтипа mPR – α, β и γ, которые отличаются у млекопитающих в зависимости от тканевого распределения, стадии репродуктивного цикла и неогенеза. Эстрадиол 17β стимулирует экспрессию mPRα и β, в то время как прогестерон увеличивает плотность лишь mPR α

подтипа мембранных рецепторов.

PGRmC1 - второй тип мембраносвязанного рецептора прогестерона -

представляет собой один раз пересекающий мембрану протеин. О механизме действия данного типа рецепторов известно немного; однако, показано, что он может образовывать комплекс с белком, связывающим ингибитор РНК активатора плазминогена (PAIRBP1), в результате чего активируются цГМФ-

зависимые протеинкиназы и протеинкиназа С [47].

После проникновения внутрь клетки стероидные гормоны связываются с цитозольными (классическими) рецепторами половых стероидов, относящихся к суперсемейству ядерных рецепторов (nuclear receptor, NR). В эту группу входят рецепторы для гидрофобных молекул, таких как эстрогены, глюкокортикоиды,