диссертации / 56

51

Метод лечения – стандартный длинный протокол с аГнРГ.

Предварительную десенситизацию гипофиза проводили агонистом гонадотропин-релизинг-гормона (аГнРГ) трипторелином – диферелином фирмы ―Beaufour Ipsen International‖, Франция (диферелин 3,75мг однократно или 0,1мг ежедневно подкожно).

Применение аГнРГ приводит к временной блокаде выработки гонадотропинов гипофизом, что, соответственно, влечѐт за собой обратимое угнетение функции яичников. Механизм действия аналогов гонадолиберина на репродуктивную систему заключается в их прочном связывании с рецепторами гонадолиберина в гонадотрофах гипофиза, что приводит сначала к кратковременной активации, а затем угнетению секреции гонадотропинов [25]. В результате возникает состояние десенситизации гипофиза и наступает временная фармакологическая кастрация.

После контроля УЗИ в начале менструального цикла, через 10-14 дней десенситизации аГнРГ начинали cтимуляцию суперовуляции препаратами гонадотропинов, рекомбинантными (фоллитропином альфа – гонал Ф фирмы

―Merck Serono‖, Швейцария, а также фоллитропином бета – пурегон фирмы

―Organon‖, Нидерланды) или мочевыми (менотропинами – менопур фирмы

―Ferring‖, Германия) в дозах от 100 до 300 МЕ на фоне продолжающегося ежедневного подкожного введения диферелина 0,1мг в половинной дозе, т.е.

по 0,05мг. В ходе стимуляции суперовуляции проводили ультразвуковой мониторинг за ростом фолликулов и эндометрия. На 6-8 день стимуляции, а

далее через 2-3 дня исследовали диаметр растущих фолликулов. Критерием окончания стимуляции фолликулогенеза являлись следующие параметры:

размер лидирующих фолликулов 18-23 мм, толщина эндометрия не менее 8-9

мм. При достижении вышеуказанных параметров назначали ―овуляторную‖ дозу хорионического гонадотропина 10000 МЕ (прегнил фирмы ―Organon‖,

Нидерланды). Поддержка лютеиновой фазы всем пациенткам назначали

52

одинаковую: микронизированный прогестерон (утрожестан фирмы ―Besins‖) 600 мг/сут в 3 приема интравагинально до результата на ХГЧ, в случае наступления беременности – еще, как минимум, 2 недели.

Данный протокол применялся во всех 50 случаях.

Трансвагинальная пункция и аспирация преовуляторных ооцитов проводили через 35-36 часов после инъекции ХГЧ. Пункцию производили в амбулаторных условиях, на гинекологическом кресле с помощью ультразвукового аппарата фирмы ―Bruel & Kier‖ (Дания). На влагалищный датчик надевали специальный адаптер для фиксации иглы. Пукцию проводили под контролем ультразвуковой картины на мониторе одноразовыми пункционными однопросветными иглами фирмы ―Wallace‖

(Великобритания), соединенными проводниками с автоматической аспирационной системой. На экране монитора направление иглы определялось специальной пунктирной линией.

Спомощью вакуумного отсоса, под давлением 20 мм рт.ст.

фолликулярную жидкость аспирировали в стерильные флаконы.

Полученную фолликулярную жидкость передавали эмбриологу с целью идентификации ооцитов, их отбора и последующего оплодотворения, а

также дальнейшего культивирования полученных эмбрионов.

Преовуляторные ооциты помещали в питательную среду для культивирования, в специальный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия при 5% СО2 в воздухе и с влажностью до 95%.

Сперму мужа подвергали специальной обработке – центрифугированию,

флотированию для увеличения подвижности сперматозоидов путѐм очистки от лейкоцитов и неподвижных сперматозоидов.

После 4-5 часов инкубации производили инсеминацию ооцитов сперматозоидами из расчѐта не менее 50000 в 1 мл. Далее в течение 2-5-ти

53

дней проводили культивирование эмбрионов до стадий раннего эмбриогенеза.

Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли через 48-120 часов после начала культивирования in vitro. Перенос выполняли в амбулаторных условиях в операционной на гинекологическом кресле. Условия инкубации эмбрионов при этом были одинаковы для всех пациенток исследования.

Одной пациентке переносили до 3-х эмбрионов под контролем УЗИ абдоминальным датчиком аппарата фирмы ―Bruel & Kier‖ (Дания).

Эмбрионы на стадиях 2-10 бластомеров или на стадии бластоцисты набирали в специальный стерильный одноразовый катетер (мягкий катетер фирмы ―Wallace‖, Великобритания или ―Labotech‖, Германия). При невозможности пройти цервикальный канал мягким катетером использовали наборы Set TDT фирмы ―C.C.D. International‖, Франция. Эмбрионы в катетере с минимальным количеством среды (10-15 мл) вводили через цервикальный канал и переносили в середину полости матки.

2.3.2. Определение уровня цитозольных рецепторов половых

стероидов в эндометрии.

А) Получение цитозольной фракции из ткани эндометрия.

Образцы эндометрия измельчали ножницами, а затем в микроразмельчителе тканей РТ-2 при 3000 об/мин в течение 5-ти минут с 3-х

секундным перерывом через каждые 5 секунд, в 5-6 объемах ТЭД-буфера рН

7,4, содержащего 10% глицерина. Гомогенат центрифугировали в течение 15

минут при 1500 g на центрифуге РС-6. Из супернатанта получали цитозольную фракцию, центрифугируя пробы при 105000 g в течение 60

минут, в которой определяли содержание цитозольных рецепторов прогестерона и эстрадиола (ультрацентрифуга UP-65M). Супернатант,

представляющий собой цитозольную фракцию, осторожно сливали. Все операции проводили в температурном режиме 0-40С.

54

Б) Определение белка в цитозольной фракции.

Белок определяли методом Lowry [104]. В качестве стандарта использовали БСА.

В) Определение связывания прогестерона (3Н-Р4) и эстрадиола (3Н-Е2) в

цитозольной фракции эндометрия.

Определение рецепторов прогестерона и эстрадиола в цитозольной фракции проводили радиолигандным методом [2]. Для определения общего связывания пробы содержали 20 мкМ 3Н-Р4 и 1мМ гидрокортизона или 5

мкМ 3Н-Е2 в исследуемой фракции ткани. Для определения неспецифического связывания пробы дополнительно содержали 3 мМ прогестерон и 1 мМ диэтилстильбэстрола соответственно, стероиды вносили в пробирки в виде спиртового раствора. Этанол, после раскапывания,

испаряли в токе азота. Затем для определения связывания прогестерона добавляли исследуемую фракцию ткани (цитозольная фракция 1-5 мг белка/мл), тщательно встряхивали и инкубировали 2 часа, после чего добавляли 100 мкл ТЭД - буфера с 50% глицерином, встряхивали и инкубировали еще 2 часа. После чего добавляли по 200 мкл суспензии активированного угля, тщательно встряхивали и инкубировали 30 минут.

Затем пробы центрифугировали в течение 15 минут при 1500 g и 200 мкл надосадочной жидкости из каждой пробы помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости для радиометрирования.

Для определения связывания эстрадиола добавляли исследуемую фракцию ткани (цитозольная фракция 1-5 мг белка/мл), тщательно встряхивали и инкубировали 18-20 часов, после чего добавляли по 100 мкл суспензии активированного угля, тщательно встряхивали и инкубировали 15

минут. Затем пробы центрифугировали в течение 15 минут при 1500 g и 100

мкл надосадочной жидкости из каждой пробы помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости для радиометрирования. Все исследования проводили в триплетах.

55

Связывание стероидных гормонов в цитозоле выражали в фемтомолях гормона, связанного одним мг цитозольного белка. Эту величину рассчитывали по формуле 1:

N = (T-NSB)*К/(2,22хАхC), где

N – специфическое связывание (фемтомоль/мг белка цитозоля);

Т - средняя величина общего (в отсутствии конкурента-избыточного количества немеченого гормона) связывания меченого гормона в имп/мин.,

регистрируемых -радиометром;

NSB - средняя величина неспецифического (в присутствии конкурента-

избыточного количества немеченого гормона) связывания в аналогичной аликвоте в имп/мин., регистрируемых -радиометром;

К - коэффициент, учитывающий разведение пробы суспензией угля и эффективность счета -радиометра;

2,22-коэффициент пересчета из имп./мин, регистрируемых -

радиометром, в Ci /mmol;

А - удельная радиоактивность 3Н-стероида в Ci/mmol

С - концентрация белка в аликвоте в мг/мл.

Г) Жидкостная сцинтилляционная радиометрия.

В основе метода лежит свойство -частиц вызывать сцинтилляцию веществ в специальных средах. Это дает возможность с большой эффективностью регистрировать -излучение, обладающее малой энергией.

Для регистрации радиоактивности 200 мкл образца помещали во флаконы с 5

мл сцинтилляционной жидкости. Смесь перемешивали, и радиоактивность образца регистрировали на жидкостном сцинтилляционном радиометре SL30 Intertechnique. Эффективность счета для 3Н составила 50-55%.

56

2.3.3. Определение уровня рецепторов половых стероидов в МНФ клеток

периферической крови.

А) Выделение мононуклеарной фракции крови по методу Boyum [39].

Кровь с гепарином (10 мл) разводили таким же количеством раствора прозрачного Хэнкса, т. е. в соотношении 1:1 (по обьему). Затем кровь с Хэнксом в объеме 5 мл наслаивали на 3 мл теплого раствора фиколла– урографина. Затем центрифугировали 45 минут при 2000 об/мин. После центрифугирования стерильной пипеткой отбирали фракцию мононуклеаров.

Полученную фракцию переносили в чистую пробирку и доводили раствором Хэнкса до 10 мл. Далее центрифугировали 15 минут при 1600 об/мин. После чего сливали надосадочную жидкость и осадок доводили раствором Хэнкса до 10 мл, затем центрифугировали 15 минут при 1600 об/мин. Далее сливали надосадочную жидкость и получали суспензию МНФ, путем ресуспензирования осадка с остатками раствора Хэнкса. Все операции проводили в температурном режиме 0-40С. Клеточный состав выделенной фракции МНФ периферической крови оценивали с помощью проточной цитофлюориметрии

Б) Определение специфического связывания прогестерона (3Н-Р4) и

эстрадиола (3Н-Е2) в МНФ клеток периферической крови.

Определение специфического связывания прогестерона и эстрадиола в мононуклеарной фракции проводили радиолигандным методом [2]. Для определения общего связывания пробы содержали 20 мкМ 3Н-Р4 и 1мМ гидрокортизона или 5 мкМ 3Н-Е2. Для определения неспецифического связывания пробы дополнительно содержали 3 мМ прогестерона или 1 мМ диэтилстильбэстрола соответственно, стероиды вносили в лунки 96-

луночного планшета в виде спиртового раствора. Этанол, после раскапывания, испаряли в токе азота. Затем добавляли исследуемую фракцию крови (0,5 – 1 млн/клеток на лунку) и инкубировали 60 минут для

57

определения связывания прогестерона и 30 минут – для эстрадиола, после чего по 100 мкл суспензии из каждой лунки помещали на стеклянные фильтры Whatman GF/B и промывали 100 кратным избытком ТЭД - буфера.

Стеклянный фильтр из каждой пробы помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости для радиометрирования. Все исследования проводили в триплетах.

Связывание стероидных гормонов в МНФ выражали в фемтомолях гормона, связанного одним мкл фракции. Эту величину рассчитывали по формуле 1.

В) Определение специфического связывания дидрогестерона в МНФ клеток периферической крови.

Для оценки взаимодействия дидрогестерона с рецепторами прогестерона использовали мононуклеарную фракцию периферической крови в которой предварительно определяли содержание рецепторов прогестерона радиолигандным методом [2].

Величину специфического связывания дидрогестерона (9β, 10α - прегна - 4, 6 - диен - 3, 20 – дион, «Serva», Германия) с рецепторами прогестерона (%

ингибирования специфического связывания 3Н-прогестерона дидрогестероном)

вычисляли по формуле 2 [26]:

И= (В спец. преп./В спец. горм.)*100%, где

И– ингибирование специфического связывания с рецептором 3Н-

прогестерона дидрогестероном,

В спец. преп. – специфическое связывание 3Н-прогестерона в присутствии избытка дидрогестерона;

В спец. горм. – специфическое связывание 3Н-прогестерона в отсутствии дидрогестерона

58

Д) Метод проточной цитофлюориметрии (проточный цитофлюориметр сортер FACSAria (Becton Dickenson Co)).

Окрашивание производили в пробирках типа Eppendorf объемом 1,5 мл по следующей схеме:

Клетки (приблизительно 1 млн.) разбавляли в 100 мкл буфера для окрашивания. В каждую пробирку добавляли по 15 мкл меченых антител к одному из изучаемых поверхностных маркеров (анти-CD-3 к Т-лимфоцитам,

анти-CD-19 к В-лимфоцитам, анти-CD-14 к моноцитам). В образцы,

служащие отрицательным контролем, добавляли соответствующие изотипические антитела.

Клеточную суспензию перемешивали несколько секунд на вихревой мешалке и инкубировали в холодильнике при температуре +4оС в течение 60

минут. После инкубации клетки осаждали центрифугированием при 5000

об/мин в течение 4 мин. После удаления супернатанта, клетки отмывали 2

раза в 1 мл буфера для окрашивания.

После удаления супернатанта клетки фиксировали в 0,5 мл 2% раствора параформальдегида и доводили конечный объем до 1 мл раствором PBS

(натрий-фосфатный буфер).

Полученную клеточную суспензию фильтровали через фильтр с диаметром пор 30 мкм для исключения клеточных агрегатов.

2.3.4. Выделение РНК из клинического материала.

Выделение мРНК из клеток МНФК периферической крови проводили с помощью набора «Рибо-преп» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.

А) Реакция обратной транскрипции.

59

Получение кДНК на матрице мРНК проводили с использованием комплекта готовых реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инстукции производителя.

Б) Полимеразная цепная реакция в реальном времени (PCR-RT) для определения уровня экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона с контрольным геном Gapdh.

Для реакции использовали набор готовых реактивов для ПЦР в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I "Реакционная смесь

2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I" на приборе iCycler iQ5 real-time PCR («Синтол» Россия). В качестве контрольного гена использовали ген Gapdh.

Схема ПЦР-РТ:

1.Приготовление реакционной смеси на 12 реакций: смешать 117 мкл

H2Oд, 117 мкл MIX-смеси, 13 мкл MgCl2, перемешать на вортексе,

отобрать 19 мкл для контроля красителя.

2.Добавить по 24 мкл верхнего и нижнего праймеров (up и low),

перемешать на вортексе, отобрать по 23 мкл для контроля праймеров

(последовательности праймеров приведены в таблице 2.1.)

3.Разлить готовую реакционную смесь по 200 мкл эппендорфам.

4.Добавить в эппендорфы с готовой смесью по 2 мкл кДНК, тщательно перемешать и поставить в амплификатор.

5.Запустить программу амплификации:

а) 1 цикл: 10:00 мин – 950С

б) 2-40 циклы: 00:15 мин - 950С

6. Запустить программу плавления:

a) 1 цикл: 01:00 мин – 950C

60

б) 2 цикл: 01:00 мин – 550С

в) 3-84 цикл: 00:10 мин – 550

Таблица 2.1. Последовательности праймеров для определения экспрессии генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК.