- •Векторные системы теория
- •1. Принципы и понятия технологии рекомбинантных молекул. Основные открытия молекулярной биологии, обосновавшие возможность конструирования рекомбинантных молекул.
- •2. Матричные процессы. Репликон и типы репликации днк. Стабильность наследования генетических структур.
- •3. Механизмы реализации генетической информации.
- •4. Молекулярное клонирование как способ исследования структурной организации генетических элементов и систем экспрессии чужеродной генетической информации.
- •5. Понятие вектора. Характеристика основных генетических элементов про- и эукариотических клеток, претендующих на роль векторов.
- •6. Общие свойства клонирующих векторов. Принципы клонирования днк in vivo и in vitro.
- •7. Рестрикционные нуклеазы и их характеристика.
- •8. Способы объединения фрагментов днк. Днк-лигазы. Днк-полимераза
- •12. Концевая трансфераза и ее применение при создании рекомбинантных молекул.
- •13. Векторные молекулы днк. Развитие представлений о векторных молекулах.
- •14. Введение молекул днк в клетки.
- •15. Требования к клеткам-хозяевам рекомбинантных молекул.
- •16. Структурно-генетическая организация полового фактора.
- •17. Плазмиды бактерий и их общие свойства.
- •18. Сегрегационная и структурная нестабильность плазмид.
- •19. Классификация плазмид.
- •20. Плазмиды бактериоциногенности и векторы на их основе.
- •21. Плазмиды лекарственной устойчивости бактерий.
- •22. Конструирование и структура «искусственных» векторов (плазмиды pRsf2124 и рМв9).
- •23. Принцип модульной организации плазмид.
- •24. Мигрирующие элементы и конструирование векторов для клонирования хромосомных генов бактерий in vivo.
- •25. Трансдуцирующие бактериофаги.
- •26. Организация генома бактериофага лямбда.
- •27. Общая и генерализованная трансдукция.
- •28. Характеристики pBr322, ее преимущества и недостатки.
- •29. Векторы на основе репликонов бактериальной плазмиды puc18, puc19.
- •30. Свойства бактериофага лямбда как универсальной системы для клонирования in vivo и in vitro.
- •31. Молекулярные векторы на основе генома бактериофага лямбда.
- •32. Космиды.
- •33. Фазмиды.
- •34. Искусственные хромосомы (рас, вас, yac)
- •35. Конструирование библиотек и клонотек.
- •36. Нитевидные фаги в качестве клонирующих векторов.
- •37. Конструкция и использование векторов на основе нитевидных фагов.
- •38. Векторы, предназначенные для изучения регуляции экспрессии генов.
- •39. Векторы для Bacillus.
- •40. Проблемы плазмидных векторов.
- •41. Челночные векторы.
- •42. Генетическая организация дрожжей.
- •43. Внехромосомные элементы сахаромицетов.
- •44. Введение днк в дрожжевые клетки.
- •45. Векторы для дрожжевых клеток. Требования к вектору.
- •46. Селективные маркеры дрожжей. Принципы клонирования.
- •47. Введение молекул днк в клетки млекопитающих.
- •48. Организация генома вируса sv40. Векторы на основе вируса sv40.
- •49. Основные проблемы при конструировании векторов млекопитающих.
- •50. Векторы для клонирования в растениях.
- •51. Молекулярная биология Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens.
- •52. Структура т-днк. Использование Ti-плазмиды в качестве векторов для создания трансгенных растений.
- •53. Бинарные системы.
- •54. Вирусы как векторы для растений.
43. Внехромосомные элементы сахаромицетов.
Ответ. При создании систем экспрессии рекомбинантных генов на основе дрожжей в настоящее время используются четыре типа векторов, которые различаются по способу, которым они обеспечивают существование чужеродной ДНК в дрожжевых клетках. Векторы первого типа, к которым относятся, в частности, векторы на основе дрожжевой интегрирующейся плазмиды Yip, используются для встраивания рекомбинантной ДНК в хромосомы дрожжей. У этих векторов отсутствует область начала репликации и они не способны самовоспроизводиться в трансформированных клетках. Поэтому единственным способом сохранения их последовательностей в клетках дрожжей является совместная репликация в составе хромосом. Второй тип векторов принадлежит к семейству дрожжевых реплицирующихся плазмид YRp. Эти плазмиды способны к автономной репликации в клетках дрожжей благодаря наличию у них ARS-последовательностей, о которых уже упоминалось в связи с искусственными хромосомами дрожжей (YAC). ARS-последовательности, по-видимому, представляют собой области начала репликации на хромосомах дрожжей. Векторы третьего шипа образуют так называемое семейство дрожжевых центромерных плазмид YCp, которые, как и следует из их обозначения, содержат в своем составе цетромер-ные последовательности хромосом дрожжей и обладают способностью не только к автономной репликации, но и более стабильному существованию в клетках дрожжей в виде внехромосомных элементов по сравнению с векторами предыдущего семейства. Наконец, векторы семейства дрожжевых эписомных плазмид YEp получены из природной многокопийной кольцевой плазмиды дрожжей (2 fim), и объединяют в себе большинство положительных качеств вышеупомянутых векторов. Они существуют в клетках дрожжей во внехромосомном состоянии в большом числе копий, автономно реплицируются и стабильно сегрегируют между делящимися клетками. Все перечисленные векторы являются челночными, т.е. допускают проведение этапов субклонирования фрагментов ДНК и наработки их в большом количестве с использованием клеток Е. coli. Это становится возможным благодаря наличию у них области начала репликации плазмиды pBR322, а также селектируемых маркеров, придающих бактериальным клеткам устойчивость к ампициллину и тетрациклину, соответственно. Селективный характер роста клеток дрожжей при наличии у них векторных молекул также обеспечивают селектируемые маркеры векторных плазмид. К ним относятся гены, дающие возможность деления ауксотрофных штаммов дрожжей на средах без соответствующих пищевых добавок: URA3, LEY2, HIS3, TRP1 или LYS2, которые восстанавливают способность ауксотрофов синтезировать, соответственно, урацил, а также аминокислоты Leu, His, Тгр или Lys. Эффективную транскрипцию рекомбинантных генов в клетках дрожжей обеспечивают специфические регуляторные элементы, промоторы и терминаторы транскрипции. Высокий уровень синтеза РНК на клонированных последовательностях в клетках S. cerevisiae может иметь место при использовании промоторных участков генов гликолиза: GAL4, ADH, PGK или GAPDH. При этом для исключения отрицательного влияния рекомбинантных белков на дрожжевые клетки промоторы должны быть индуцируемыми. Фрагменты ДНК, выполняющие роль терминаторов транскрипции часто берут начало от 3’-концевых последовательностей генов PGK, РН05 или TRP1. При этом последовательности 3’-концевых нетранслируемых участков генов могут оказывать большое влияние на эффективность транскрипции и трансляции клонированных рекомбинантных последовательностей.