20. Плазмиды бактериоциногенности и векторы на их основе.

Ответ. Бактериоциногенные плазмиды (например, Col-плазмида у E. Coli содержат гены, ответственные за синтез бактериоцинов). Бактериоцины – антибиотические вещества белковой природы, синтезируемые бактериями и подавляющие рост и размножение близкородственных микроорганизмов, не лизирую последних. Синтез бактерицинов является для клетки-продуцента летальным, но потенциальные бактерии-продуценты, не продуцирующие их в данный момент, устойчивы к воздействию бактериоцинов. В отличии от других плазмид, факторы бактериоциногенности реже интегрируются в хромосому, редко элиминируются, многие не обладают конъюгативностью. Многие плазмиды, кодирующие образование бактериоцинов, также содержат набор генов, ответственных за конъюгацию и перенос плазмид. Подобные плазмиды относительно крупные (молекулярная масса 25–150*10⁶D), их довольно часто выявляют у грамотрицательных палочек. ColE1 – вектор молекулярного клонирования размером 6.6 Кб. Плазмида имеет ослабленный контроль репликации: при обычных условиях роста в клетке имеется 20–30 копий. После обработки хлорамфениколом количество копий увеличивается до 1–3 тыс. При этом плазмидная ДНК составляет более половины всей ДНК клетки, что упрощает процедуру выделения и очистки плазмиды. В плазмиде имеется 1 сайт узнавания рестриктазой EcoRI. Плазмида обуславливает одновременно синтез в клетке колицина (содержит структурный ген колицина E1 cea) и иммунность к летальным дозам колицина. Колицин – это тип бактериоцина, который вырабатывается некоторыми штаммами Escherichia coli и токсичен для них. Колицины выбрасываются в окружающую среду, чтобы снизить конкуренцию со стороны других штаммов бактерий. Колицины связываются с рецепторами внешней мембраны, используя их для перемещения в цитоплазму или цитоплазматическую мембрану, где они проявляют свой цитотоксический эффект, включая деполяризацию цитоплазматической мембраны, активность ДНКазы, активность РНКазы или ингибирование синтеза муреина. Кроме этих трех генов, имеется еще ген, кодирующий белок Kil. Гены cea и kil образуют единый оперон. Белок Kil обуславливает высвобождение колицина E1 из бактерий в окружающую среду. При встройке экзогенных фрагментов ДНК по EcoRI-месту нарушается ген продукции колицина, но сохраняется ген иммунности к нему – это является основой для отбора трансформантов, содержащих гибридные плазмиды. Способ отбора таков: трансформантов высевают на среду, содержащую колицин E1; клетки, выросшие на такой среде, содержат либо исходную плазмиду ColE1, либо ее гибридные производные; в другой ЧП равномерно засевают E. coli, чувствительную к колицину E1 (Cols) – получают газон; колонии, устойчивые к колицину, перепечатывают единообразно на засеянную и незасеянную чашки; на чашках с газоном E. coli Cols вокруг напечатанных сверху колоний, продуцирующих колицин, наблюдается кольцевая прозрачная зона, где рост газона отсутствует – такие клоны содержат нативную плазмиду ColE1. Другие клоны (выросшие на незасеянной чашке) содержат гибридные варианты ColE1, у которых в результате встройки чужДНК ген продукции колицина поврежден. Недостаток такой фенотипической селекции в том, что бактериальные клетки могут приобретать устойчивость к колицину путем спонтанных мутаций.