
- •Векторные системы теория
- •1. Принципы и понятия технологии рекомбинантных молекул. Основные открытия молекулярной биологии, обосновавшие возможность конструирования рекомбинантных молекул.
- •2. Матричные процессы. Репликон и типы репликации днк. Стабильность наследования генетических структур.
- •3. Механизмы реализации генетической информации.
- •4. Молекулярное клонирование как способ исследования структурной организации генетических элементов и систем экспрессии чужеродной генетической информации.
- •5. Понятие вектора. Характеристика основных генетических элементов про- и эукариотических клеток, претендующих на роль векторов.
- •6. Общие свойства клонирующих векторов. Принципы клонирования днк in vivo и in vitro.
- •7. Рестрикционные нуклеазы и их характеристика.
- •8. Способы объединения фрагментов днк. Днк-лигазы. Днк-полимераза
- •12. Концевая трансфераза и ее применение при создании рекомбинантных молекул.
- •13. Векторные молекулы днк. Развитие представлений о векторных молекулах.
- •14. Введение молекул днк в клетки.
- •15. Требования к клеткам-хозяевам рекомбинантных молекул.
- •16. Структурно-генетическая организация полового фактора.
- •17. Плазмиды бактерий и их общие свойства.
- •18. Сегрегационная и структурная нестабильность плазмид.
- •19. Классификация плазмид.
- •20. Плазмиды бактериоциногенности и векторы на их основе.
- •21. Плазмиды лекарственной устойчивости бактерий.
- •22. Конструирование и структура «искусственных» векторов (плазмиды pRsf2124 и рМв9).
- •23. Принцип модульной организации плазмид.
- •24. Мигрирующие элементы и конструирование векторов для клонирования хромосомных генов бактерий in vivo.
- •25. Трансдуцирующие бактериофаги.
- •26. Организация генома бактериофага лямбда.
- •27. Общая и генерализованная трансдукция.
- •28. Характеристики pBr322, ее преимущества и недостатки.
- •29. Векторы на основе репликонов бактериальной плазмиды puc18, puc19.
- •30. Свойства бактериофага лямбда как универсальной системы для клонирования in vivo и in vitro.
- •31. Молекулярные векторы на основе генома бактериофага лямбда.
- •32. Космиды.
- •33. Фазмиды.
- •34. Искусственные хромосомы (рас, вас, yac)
- •35. Конструирование библиотек и клонотек.
- •36. Нитевидные фаги в качестве клонирующих векторов.
- •37. Конструкция и использование векторов на основе нитевидных фагов.
- •38. Векторы, предназначенные для изучения регуляции экспрессии генов.
- •39. Векторы для Bacillus.
- •40. Проблемы плазмидных векторов.
- •41. Челночные векторы.
- •42. Генетическая организация дрожжей.
- •43. Внехромосомные элементы сахаромицетов.
- •44. Введение днк в дрожжевые клетки.
- •45. Векторы для дрожжевых клеток. Требования к вектору.
- •46. Селективные маркеры дрожжей. Принципы клонирования.
- •47. Введение молекул днк в клетки млекопитающих.
- •48. Организация генома вируса sv40. Векторы на основе вируса sv40.
- •49. Основные проблемы при конструировании векторов млекопитающих.
- •50. Векторы для клонирования в растениях.
- •51. Молекулярная биология Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens.
- •52. Структура т-днк. Использование Ti-плазмиды в качестве векторов для создания трансгенных растений.
- •53. Бинарные системы.
- •54. Вирусы как векторы для растений.
28. Характеристики pBr322, ее преимущества и недостатки.
Ответ. pBR322 – плазмида, используемая в бактериях E. coli как вектор клонирования. pBR322 содержит 4361 нуклеотидную пару и состоит из участка репликации ori (взят из плазмиды pMB1); гена ampR, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (взят из плазмиды RSF2124) и гена tetR, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину (взят из плазмиды pSC101). Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tetR, причём 2 сайта (HindIII и ClaI) расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена ampR. Участок репликации ori, заимствованный из плазмиды pMB1, сходен по структуре с ColE1. Он кодирует две РНК (RNA I и RNA II) и один белок (Rom или Rop). Нумерацию нуклеотидных пар принято начинать с центральной линии уникального сайта рестрикции EcoRI в направлении гена tet. Ген устойчивости к ампициллину – пенициллиновая бета-лактамаза с промотерами P1 и P3. P3 является естественным промотором, а P1 создан искусственно лигированием двух различных фрагментов ДНК. Промотер P2 аналогичен P1, однако расположен на противоположной стороне плазмиды и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину. Клетки E.coli, содержащие pBR322, выращивают на питательных средах c ампициллином или тетрациклином, либо с обоими антибиотиками. Если встроить какой-либо фрагмент ДНК по рестрикционному сайту, расположенному в одном из маркерных генов, то этот ген инактивируется. Так, при встраивании ДНК, например по сайту для эндонуклеазы рестрикции PstI, расположенному на участке, кодирующем устойчивость к ампициллину, не может синтезироваться белок, обеспечивающий рост клеток, содержащих такую рекомбинантную ДНК, на средах с ампициллином. Такие клетки способны расти на средах, содержащих тетрациклин, но не ампициллин. И наоборот, вставки сегментов ДНК по участкам узнавания ферментов, расположенных в гене устойчивости к тетрациклину, например HindIII или BamHI, оставляют возможность выживания клеток только на средах с ампицллином. При любой локализации вставки в молекуле вектора происходит отбор только тех бактериальных колоний, которые содержат рекомбинантные плазмидные ДНК. ДНК pBR322 разрезают эндонуклеазой рестрикции PstI в участке, определяющем устойчивость к ампициллину. Фрагменты донорной ДНК, также полученные с помощью PstI и имеющие липкие концы, как и линеаризованный вектор pBR322, с помощью ДНК-лигазы сшивают с векторной ДНК. Следствием образования такой конструкции является деструктурирование гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину. Таким образом, созданная рекомбинантная ДНК при введении в клетки E.coli не сможет обеспечить им выживание на среде с ампициллином. Клетки E.coli трансформируют рекомбинантной ДНК. Суспензию клеток после проведения процедуры трансформации высевают на чашки с агаром и питательной средой, содержащей антибиотик тетрациклин. На этом этапе происходит селекция, т.е. отбор клеток, которые способны расти на среде с тетрациклином. Выросшие на этом агаре клетки содержат рекомбинантную ДНК и ДНК pBR322, в которую не встроилась вставка донорной ДНК, т.е. восстановилась первоначальная структура вектора. Индивидуальные колонии клеток E.coli, выросшие на чашке с тетрациклином пересевают на чашки две чашки, одна из которых содержит агар с ампициллином, а вторая – с тетрациклином. Клетки, содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК, растут только на агаре с тетрациклином, поскольку ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину у них деструктурирован за счет встраивания донорной ДНК. В то время как клетки с исходной, т.е. восстановленной векторной ДНК pBR322 растут на обеих чашках, поскольку гены устойчивости к обоим антибиотикам находятся в нативном, т.е. в исходном состоянии. Из клеток отобранных клонов E.coliэкстрагируют плазмидную ДНК и анализируют ее структуру. Создание плазмиды pBR322. Ряд плазмид E. coli имеют своего рода родословную. Путь конструирования pBR322 начался с участие pRSF2124 в pMB9 -> была получена плазмида pBR312, несущая маркеры Apr и Tcr. Из плазмиды pBR312 удалили одно из 2-х мест узнавания BamHI, и получили плазмиду pBR313. Затем через промежуточные плазмиды pBR318 и pBR320 получили pBR321, а случайную плазмиду с делецией, производную от pBR321, назвали pBR322. Таким образом, конструирование новых плазмид идет через перенос транспозонов, направленные делеции (для уменьшения размера плазмиды) и лигирования продуктов рестрикции плазмид.