Molekuljarnaja Biologija Kletki v3

463

Рис. 21-19. Типичные аномалии в морфологии ядра раковой клетки (в данном случае при эритролейкозе). Ядро такой клетки необычно велико, имеет оболочку с беспорядочно расположенными складками и ядрышко, которое также аномально увеличено и характеризуется сложной структурой. (С любезного разрешения D. Friends.)

репликации, рекомбинации и репарации ДНК. Например, у людей с редким наследственным заболеванием «пигментная ксеродерма» обнаружен дефект в системе ферментов, необходимых для репарации повреждений ДНК, вызванных ультрафиолетовым облучением (см. разд. 5.2.8). Это приводит к тому, что даже непродолжительное пребывание на солнце может спровоцировать возникновение рака кожи. Предрасположенность к раку более общего характера наблюдается при синдроме Блума, когда имеется дефект фермента ДНК-лигазы, необходимой для репликации и репарации ДНК, и при анемии Фанкони и атаксии-телангиэктазии, когда существуют нарушения тех же функций, но менее охарактеризованные. При этих редких генетических расстройствах аномалия наследуется через половые клетки и поэтому присутствует во всех клетках организма. Однако сходные генетические дефекты в метаболизме ДНК могут появляться также в результате мутаций в соматических клетках, и есть основания предполагать, что такие аберрации являются общим и важным фактором в развитии многих злокачественных новообразований.

Опухолевые клетки нередко обнаруживают аномальную вариабельность формы и размеров ядер (рис. 21-19), а также числа и структуры хромосом; и на практике изменения в морфологии ядер являются для патологов одним из ключевых признаков в диагностике рака. При культивировании опухолевых клеток их кариотип часто оказывается крайне нестабильным: могут наблюдаться амплификация или делеция генов, потеря, дупликация или транслокация хромосом (или их участков) - все это регистрируется с гораздо большей частотой, чем при культивировании нормальных клеток. С одной стороны, такая вариабельность в числе и структуре хромосом может быть просто следствием ускорения клеточного цикла, возникающего в дифференцированной клетке из-за ее слабой адаптации к быстрой пролиферации. С другой стороны, это может отражать наследуемый дефект в самом механизме или регуляции процессов репарации, репликации или рекомбинации ДНК, возникающий в результате соматической мутации в любом из множества вовлеченных в эти сложные процессы генов. Такая мутация будет увеличивать вероятность всех последующих мутаций в других группах генов. Поэтому можно ожидать, что описанный механизм является общим для клеток, претерпевших множество мутаций, необходимых для превращения их в злокачественные. Предположим, к примеру, что для трансформации нормальной клетки в опухолевую необходимы три мутации в генах, контролирующих поведение клеток, и что вероятность каждой такой мутации за время жизни человека составляет 10-4 на клетку. Тогда вероятность того, что одна нормальная клетка успеет (даже за весь указанный промежуток времени) «накопить» эти три мутации, будет 10-4 х 10-4 х 10-4 = 10-12. Но допустим теперь, что скорость мутирования возросла из-за предшествующей мутации в каком-нибудь из ферментов системы репликации или репарации ДНК и достигла 10-2/клетку за время жизни человека. Приняв вероятность этой мутации в системе репарации/репликации стандартной - 10-4, мы увидим, что этот путь, который начинается с мутации, увеличивающей мутабильность, приведет к более частому возникновению раковых клеток: суммарная вероятность превращения клетки в раковую составит в течение жизни 10-4 х 10-2 х 10-2 х 10-2 = 10-10. Это в 100 раз более вероятно, чем в первом случае, хотя и требует не трех, а четырех мутаций.

464

21.1.13. Высокая мутабильность раковых клеток способствует появлению у них устойчивости к противоопухолевым препаратам [10, 14]

Чем бы ни объяснялась высокая мутабильность раковых клеток, в большинстве опухолей они весьма гетерогенны во многих отношениях, и, кроме того, способны изменяться с пугающей скоростью под влиянием новых факторов отбора; естественно, это лишь усугубляет трудности терапии рака. Длительное лечение препаратами, избирательно токсичными для делящихся клеток, позволяет убить большинство опухолевых клеток у больного, но уничтожить их полностью удается редко - обычно какая-то малая часть их оказывается устойчивой к данному препарату (или классу препаратов). Более того, иногда прием какого-либо препарата обусловливает резистентность не только к нему, но и к другим препаратам, с которыми клетки больного никогда не контактировали.

Этот феномен множественной лекарственной (мультилекарственной) резистентности часто коррелирует с любопытным изменением в кариотипе: в клетках обнаруживаются дополнительные пары маленьких хромосом, так называемые двойные минихромосомы, или гомогенно окрашиваемая область, встроенная в одну из обычных хромосом и нарушающая нормальную картину ее исчерченности. Обе эти аберрации являются результатом огромной амплификации небольшого сегмента генома (см. ниже, рис. 21-26 и 21-31). При клонировании такой амплифицированной ДНК выяснилось, что в ней часто находится специфический ген, известный как ген множественной лекарственной устойчивости (mdr 1). Он кодирует одну из транспортных АТРаз плазматической мембраны, которая, как полагают, предотвращает внутриклеточное накопление определенных классов жирорастворимых препаратов, «откачивая» их из клетки. Амплификация других типов генов также может придавать опухолевым клеткам избирательное преимущество - при лечении антагонистом фолиевой кислоты метатрексатом часто происходит амплификация гена дигидрофолатредуктазы (ДГФР); в некоторых опухолях, как мы увидим ниже, аналогичным образом оказываются амплифицированными определенные протоонкогены, участвующие в регуляции клеточного деления (см. разд. 21.2.8).

Дефекты в процессах репликации, рекомбинации или репарации ДНК, делая опухолевые клетки эволюционно более гибкими за счет увеличения мутабильности, одновременно делают их и более уязвимыми к воздействиям определенного характера. Именно этим можно объяснить хорошо известный факт, используемый в терапии, что клетки многих опухолей гораздо легче, чем нормальные, можно убить облучением или обработкой специфическими веществами, вмешивающимися в метаболизм ДНК. Более полное изучение молекулярных механизмов репликации, репарации и рекомбинации ДНК позволит разработать тесты для выявления нарушений этих процессов в каждом конкретном случае рака. Обладая такой информацией, мы смогли бы с большим успехом уничтожать клетки-нарушители, подбирая лекарства, бьющие по их «слабым местам».

Заключение

Раковые клетки, согласно определению, не подчиняются существующему в норме контролю размножения (и потому называются неопластическими), и, кроме того, способны проникать в окружающие ткани и образовывать в них колонии - метастазы (т.е. являются злокачественными). Способность к метастазированию (образованию вторичных опухолей) затрудняет хирургическое лечение опухолей. Раковые клетки обычно

465

сохраняют многие черты клеток, из которых они произошли («родительских» клеток). Большинство опухолей развивается из единственной клетки, претерпевшей соматическую мутацию; но прежде, чем дать начало раковой опухоли, в потомстве этой клетки должны произойти некоторые изменения (возможно, несколько дополнительных мутаций). Этот феномен - опухолевая прогрессия, растягивающаяся обычно на годы ,- представляет собой эволюцию соматических клеток на основе мутаций и естественного отбора. Процесс может быть ускорен мутагенными агентами (опухолевыми инициаторами) и некоторыми воздействиями немутагенной природы (опухолевыми промоторами), влияющими на экспрессию генов, стимулирующими пролиферацию клеток и изменяющими «экологический баланс» между нормальными и мутантными клетками. Поскольку в развитие каждого конкретного случая рака вносит свой вкад множество факторов и поскольку действие некоторых из них, являющихся элементами внешней среды, можно устранить, оказывается в принципе возможным и предотвращение значительной части онкологических заболеваний.

Множество исследований в онкологии было посвящено поиску методов лечения, которые бы избирательно уничтожали опухолевые клетки, не затрагивая при этом их нормальных соседей. Для рационального решения этой проблемы необходимо понять, какие специфические свойства раковых клеток обеспечивают их развитие, размножение и распространение. Так, пролиферация опухолевых клеток часто сопряжена, по-видимому, с нарушением процесса дифференцировки, когда потомство стволовой клетки продолжает делиться вместо того, чтобы перейти в терминальную (неделящуюся) стадию; в принципе, пролиферацию можно подавить, подтолкнув клетки к дифференцировке. Для превращения в злокачественную опухолевая клетка должна приобрести способность проникать через базальную мембрану. Эту способность раковой клетки можно блокировать с помощью соответствующих антител, тем самым подавляя метастазирование. Мутабильность раковых клеток нередко непомерно велика; это ускоряет появление у них комплекса свойств, необходимых для проявления неопластических и злокачественных характеристик, и способствует формированию устойчивости к противоопухолевым лекарственным препаратам. С другой стороны, нарушения метаболизма ДНК, лежащие в основе такой высокой мутабильности, могут делать раковые клетки весьма чувствительными к соответствующей терапии.

21.2. Молекулярная генетика рака [15]

Поскольку рак - результат серии случайных генетических событий, вряд ли найдутся хотя бы две опухоли даже одного вида, которые были бы генетически идентичны. Несмотря на это, можно ожидать, что при любой форме рака нарушаются нормальные ограничения пролиферации клеток, и для каждого типа клеток существует определенное число возможных способов реализации подобного нарушения. Более того, некоторые элементы механизма, регулирующего клеточное деление, по-видимому, одинаковы во многих или даже во всех типах клеток, и одинаково уязвимы. Фактически основной вклад в нарушение регуляции деления клеток при раке вносит относительно небольшое число генов. Идентификация и характеристика многих из них - одно из крупнейших достижений молекулярной биологии за последнее десятилетие. Пролиферация клеток может регулироваться непосредственно - через механизм, заставляющий клетку начинать очередной цикл деления (см. разд. 13.3.2), или косвенно - например, через регуляцию вступления клетки на путь терминальной дифференцировки (см. разд 17.4.1). В обоих случаях нормальные регуляторные гены можно разделить на две катего-

466

рии - те, продукты которых способствуют стимуляции пролиферации клеток, и те, чьи продукты участвуют в ее торможении. Соответственно, есть два вида мутаций, ведущих к неконтролируемой пролиферации - основному свойству раковых клеток. Мутации первого типа приводят к гиперактивности «стимулирующего» гена; они доминантны (для проявления достаточно мутации в одной из двух клеточных копий такого гена), а измененный ген называется онкогеном (его нормальный аллель - протоонкогеном). Мутации второго типа приводят к инактивации «ингибирующего» гена; эти мутации рецессивны - обе клеточные копии гена должны быть инактивированы или удалены, чтобы освободить клетку от ингибирующего контроля; утерянный ген называют иногда геномсупрессором опухолевого роста, или опухолевым супрессорным геном. Помимо обычных мутаций существуют генетические изменения другого типа, которые также могут приводить к развитию рака - система контроля клеточного деления может быть разрушена чужеродной ДНК, которая вводится в клетку вирусом. В действительности изучение молекулярной генетики рака началось именно с открытия таких опухолеродных вирусов, что подготовило почву для последующего обнаружения онкогенов и протоонкогенов. Успехи в решении другой (и более трудной) задачи - идентификации и клонировании опухолевых супрессорных генов - были достигнуты сравнительно недавно (о них пойдет речь в конце этого раздела).

21.2.1. Опухоли могут вызываться как ДНК-, так и РНК-содержащими вирусами [15, 16]

И ДНК-, и РНК-содержащие вирусы (в частности, ретровирусы) могут участвовать в трансформации нормальной клетки в опухолевую. Это можно экспериментально продемонстрировать как на лабораторных животных (у которых некоторые вирусы способны вызывать рак), так и в культуре клеток, где те же вирусы изменяют поведение инфицированных клеток. Эти клетки приобретают способность к делению в условиях, при которых нормальные клетки делиться не могут (см. разд. 13.4.1, где перечислены свойства неопластически трансформированных клеток в культуре). Два интенсивно изучаемых примера таких вирусов - это SV40 (ДНК-содержащий вирус, выделенный из клеток обезьяны) и вирус саркомы Payса - куриный ретровирус. Сложнее обстоит дело с ролью вирусов в развитии рака у человека; среди множества причин, приводящих практически ко всем известным видам раковых заболеваний человека, вирусы не фигурируют. Возможно, от многих вирус-индуцированных опухолей нас защищает иммунная система, разрушающая инфицированные вирусами клетки, которые могли бы стать источником опухолей. Тем не менее сейчас имеются веские доказательства того, что причиной возникновения некоторых типов рака человека являются вирусы (табл. 21-3). Они могут оказывать либо непрямое промоторное действие, либо способствовать неопластической трансформации инфицированных клеток.

В устойчиво трансформированной вирусом клетке должно установиться равновесие, вирус не должен убивать клетку, а клетка должна сохранять вирусные гены при размножении (передавать из поколения в поколение). Обычно это осуществляется путем интеграции этих генов в одну или более клеточных хромосом. Но иногда вирусные гены существуют в клетке в виде плазмиды, реплицирующейся одновременно с хромосомами. Так, вирус SV40 и ретровирусы встраиваются в хромосомы клеток, которые они трансформируют; папилломавирусы - класс ДНКсодержащих вирусов, вызывающих у человека образование бородавок (и, вероятно, участвующих в возникновении рака шейки матки),

467

Таблица 21-3. Вирусы, связанные с раковыми заболеваниями у человека

Для всех указанных вирусов число инфицированных людей гораздо больше числа заболевших раком: вирусы должны действовать в сочетании с другими факторами. Более того, вклад некоторых вирусов в возникновение рака только косвенный: вирус СПИДа, например, подавляет клеточную иммунную защиту; в результате клетки эндотелия, которые были трансформированы какими-то другими агентами, не уничтожаются иммунной системой, а образуют опухоль.

при одних условиях существуют в виде плазмид, при других - как интегрированные элементы. В обоих случаях они «наделяют» клетку наследственно измененным геномом. Однако ДНК-содержащие вирусы и ретровирусы отличаются друг от друга по природе генов, вызывающих неопластическую трансформацию, и по тому, какое место в обычном жизненном цикле вируса занимает трансформация клетки.

21.2.2. Нарушение контроля клеточного деления ДНК-содержащими онкогенными вирусами - часть их стратегии выживания [15, 17]

Как уже сообщалось в гл. 5 (разд. 5.5.3), размножение опухолеродных ДНК-содержащих вирусов, таких как SV40, в естественных условиях не сопровождается развитием рака. Проникнув в клетку хозяина, SV40 обычно жестко не встраивается в клеточный геном. Вместо этого кодируемый вирусным геном белок (или группа белков) быстро активирует клеточную систему репликации ДНК, и затем вирус использует ее для репликации собственной ДНК, которая в свою очередь служит матрицей для синтеза других компонентов вируса за счет клетки хозяина. Этот процесс производства вирусных частиц клеткой продолжается до тех пор, пока она не погибнет, высвобождая множество новых вирусов. Значительно реже вирус попадает в непригодную для его размножения клетку, где может пребывать сколь угодно долгое время в результате устойчивого внедрения в одну или более клеточных хромосом. В этом случае вирусный ген, ответственный за активацию репликации клеточной ДНК, также может транскрибироваться, подталкивая таким образом, клетку к вступлению в S-фазу клеточного цикла

468

Рис. 21-20. Предполагаемый механизм, с помощью которого определенные папилломавирусы могут индуцировать рак шейки матки. Данные вирусы имеют кольцевую двухцепочечную ДНК длиной около 8000 пар оснований. В клетках бородавок и других доброкачественных образований вирусные хромосомы стабильно существуют в виде плазмид и реплицируются самостоятельно. В результате редкого случайного события вирусный геном может встроиться в хромосому хозяина. При этом изменится окружение вирусных генов и нарушится контроль их экспрессии. Нерегулируемый синтез белка репликации вируса «подталкивает» клетку к вступлению в S-фазу клеточного цикла, способствуя тем самым возникновению рака.

и заставляя ее снова и снова совершать цикл деления. Вирусный ген начинает работать как онкоген, вызывая опухолевую трансформацию. Однако такой онкоген принципиально отличается от тех классов онкогенов, которые мы рассмотрим ниже, - у него нет гомолога в геноме нормальной клетки.

ДНК-содержащие вирусы - весьма разнообразная группа, но описанные общие принципы, с некоторыми изменениями (вариациями), применимы к большинству из них, вовлеченных в патогенез рака. Примером одного из вариантов являются папилломавирусы, для которых постоянная связь с клеткой организма-хозяина - неотъемлемая часть их жизненного цикла. Вирусы папилломы, как и вирус SV40, относятся к семейству паповавирусов, но они, по-видимому, могут переключаться с инфекции «непродуктивного» типа (лизогенизации) к инфекции «продуктивного» (литического) типа, и наоборот. В первом случае вирус реплицируется синхронно с клеткой, не принося ей вреда, во втором случае он быстро размножается и убивает (лизирует) клетку, высвобождая массу новых вирусных частиц, способных инфицировать другие клетки. Подобно SV40, эти вирусы способны «подчинять себе» клеточную систему синтеза ДНК, а осуществляющие эту функцию вирусные гены могут действовать как онкогены. На рис. 21-20 показано, как, вероятнее всего, вирусы папилломы участвуют в канцерогенезе шейки матки у человека.

21.2.3. Ретровирусы способны случайно захватывать онкогены [15, 18]

В отличие от ДНК-содержащих вирусов большинство ретровирусов (см. разд. 5.5.8 и 13.4.2) относительно безвредны для клеткихозяина. Зараженная клетка постоянно выделяет новые вирусные частицы, которые отпочковываются от плазматической мембраны, не вызывая неопластической трансформации клетки. Однако изредка может происходить случайное «овладение», захват ретровирусом регуляторного клеточного гена (или его испорченной копии, или фрагмента этого гена), который не используется в жизненном цикле самого вируса, но может кардинально влиять на судьбу клетки-хозяина. В частности, как мы видели в гл. 13 (разд. 13.4.2), ретровирус, подобный вирусу саркомы Рауса, захватившему клеточный онкоген (рис. 21-21), легко обнаруживается по своему доминантному трансформирующему эффекту на инфицированные клет-

469

Рис. 21-21. Структура вируса саркомы Рауса. А. Особенности организации генома по сравнению с более типичным ретровирусом (вирус мышиного лейкоза). Вирус саркомы Рауса отличается от других онкогенных ретровирусов в том отношении, что сохранил все три гена, необходимые для его жизненного цикла: gag-кодирующий полибелок, который при «разрезании» дает белки капсида; pol- кодирующий обратную транскриптазу и фермент, участвующий в интеграции хромосомы вируса в геном хозяина; еnv- кодирующий гликопротеин оболочки. В других онкогенных ретровирусах один или больше вирусных генов отсутствуют, поскольку взамен вирус приобрел трансформирующий онкоген (см. рис. 21-22). В результате трансформирующий вирус может образовывать инфекционные частицы только тогда, когда клетка одновременно заражена недефектным, нетрансформирующим вирусом-хелпером (помощником), который восполняет утерянные функции. Б. Взаимоотношения между онкогеном v-src и клеточным протоонкогеном c-src, из которого произошел онкоген. Присутствующие в гене c-src интроны из гена v-src удалены; кроме того,v-src несет мутации, изменяющие последовательность аминокислот в белке v-src, что делает его гиперактивной нерегулируемой тирозин-специфической протеинкиназой (см. разд. 13.4.5). Исследователи, работающие над проблемой рака, подвергли вирус саркомы Рауса жесткой селекции в отношении его способности трансформировать клетки. Современные штаммы делают это с необычайной быстротой и эффективностью.

ки хозяина, которые начинают бурно размножаться. Онкоген можно идентифицировать и вычленить методами молекулярной генетики, а на его основе синтезировать ДНК-зонды для выявления гомологичных генов в нормальных клетках. Таким способом было выделено более 20 онкогенов, гомологичных протоонкогенам (табл. 21-4), которые имеются в геноме любой нормальной клетки позвоночных (см. разд. 13.4.2). Эти онкогены относятся к нескольким различным семействам (см. разд. 13.4.4), среди них наиболее крупное - семейство протеинкиназных генов, к которому принадлежит и онкоген вируса саркомы Рауса -src (рис. 21-22).

Существуют два механизма превращения протоонкогена в онкоген при включении его в ретровирус: изменение последовательности или фрагментация гена, в результате чего на нем синтезируется белок с аномальной активностью, или попадание его (протоонкогена) под контроль мощных вирусных промоторов и энхансеров, что приводит к избыточному накоплению продукта или созданию неподходящих условий для его функционирования; часто происходит и то, и другое. Сходный онкогенный эффект ретровирусы могут оказывать и другим способом, без захвата клеточных генов и переноса их из клетки в клетку: ДНК-копии вирусной РНК могут просто встраиваться в геном клетки рядом с протоонкогенами или даже внутри их. Этот феномен называется вставочным (инсерционным) мутагенезом, а измененный таким образом геном наследуется всеми потомками данной клетки. Вообще, случайное встраивание ДНК-копий вирусной РНК в геном клетки - часть нормального жизненного цикла ретровируса, и если оно происходит в пределах 10 тыс. пар оснований от протоонкогена, то может вызвать аномальную активацию нарушенного встраиванием гена. Вставочный мутагенез дает возможность идентифицировать протоонкогены за счет их близости к встроенному ретровирусу. Выявленные таким способом протоонкогены оказывались теми же, которые обнаруживали и другими методами, но были среди них и новые (табл. 21-5), например, ген int-l, активируемый у мышей, зараженных вирусом опухоли молочных желез

470

Таблица 21-4. Онкогены, первоначально выявленные в составе трансформирующих ретровирусов