Molekuljarnaja Biologija Kletki v3

271

ющих участков у молекул МНС класса I данного организма (максимум шесть у человека) может связывать весьма разнообразные вирусные пептиды, специфически узнаваемые Т-клетками. Еще более загадочны в этом отношении гликопротеины МНС класса II, трехмерная структура которых, по-видимому, очень сходна со структурой молекул класса I. Хотя у индивидуума вырабатывается всего лишь примерно от 10 до 20 видов молекул класса II (каждая со своим собственным антиген-связывающим участком), эти молекулы, видимо, способны связывать практически неограниченное множество чужеродных пептидов и представлять их Т-хелперам, которые играют решающую роль почти во всех иммунных ответах.

18.6.10. Т-хелперы узнают фрагменты чужеродных антигенов в ассоциации с гликопротеинами МНС класса II на поверхности антиген-представляющих клеток [41]

Т-хелперы необходимы лимфоцитам большинства других типов для оптимального ответа на антиген. Решающую роль Т-хелперов в иммунитете драматически демонстрирует опустошительная эпидемия синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Заболевание вызывается ретровирусом (вирусом иммунодефицита человека, ВИЧ), который убивает Т-хелперы и тем самым приводит в негодность иммунную систему: больной становится восприимчивым к. заражению микроорганизмами, которые редко инфицируют здоровых людей. В результате большинство больных СПИДом умирает в течение нескольких лет после появления симптомов болезни.

Прежде чем Т-хелперы смогут помогать другим лимфоцитам отвечать на антиген, они должны быть сначала активированы сами. Эта активация происходит тогда, когда Т-хелпер узнает чужеродный антиген, связанный с гликопротеином МНС класса II на поверхности специализированной антиген-представляющей клетки. Такие клетки имеются в большинстве тканей. Они происходят из костного мозга и составляют гетерогенную популяцию, включающую дендритные клетки лимфоидных органов, клетки Лангерганса в коже и определенные типы макрофагов. Все эти специализированные антиген-представляющие клетки вместе с В-клетками, которые тоже могут представлять антиген Т- хелперам (см. ниже), и эпителиальными клетками тимуса (разд. 18.6.17) - это главные типы клеток, в норме экспрессирующих молекулы МНС класса II (см. табл. 18-2).

Разнообразные эксперименты демонстрируют центральную роль молекул МНС класса II в представлении чужеродных антигенов Т- хелперам. Например, связывание антител с этими молекулами блокирует способность клеток представлять антиген. И наоборот, фибробласты, которые не вырабатывают молекул МНС класса II и не могут представлять чужеродые антигены Т-хелперам, можно превратить в эффективные антиген-представляющие клетки путем их трансфекции геном, кодирующим молекулу МНС класса П.

Так же как и вирусные антигены, представляемые цитотоксическим Т-клеткам, антигены, представляемые Т-хелперам, - это обычно фрагменты разрушенных чужеродных белков. Полагают, что эти пептиды связаны с молекулами МНС класса II таким же способом, как пептиды вирусного происхождения с молекулами МНС класса I (см. рис. 18-53). Однако в отличие от инфицированной вирусом мишени для цитотоксической Т-клетки антиген-представляющая клетка не синтезирует чужеродный белок. Вместо этого чужеродные белки, по-видимому, поглощаются путем эндоцитоза и частично расщепляются в кислой среде эндосом или эндолизосом (разд. 6.5.9), после чего отдельные их фраг-

272

Рис. 18-54. Гипотетическая схема «обработки» белковых антигенов и их представления антиген-представляющими клетками. Было показано, что гликопротеины МНС рециркулируют (т. е. совершают кругооборот) через эндосомный компартмент; поэтому они могли бы сначала ассоциироваться с пептидными фрагментами в эндолизосомном компартменте, а затем возвращаться на клеточную поверхность со связанным пептидом (на схеме не показано).

менты возвращаются на клеточную поверхность - последовательность событий, называемая в совокупности процессингом антигена (рис. 18-54). Если блокировать эндоцитоз путем слабой фиксации антиген-представляющих клеток (например, формальдегидом) или ингибировать протеолиз в эндолизосомах и лизосомах (например, хлорохином), эти клетки уже не могут осуществлять процессинг чужеродного белка и представлять его Т- хелперам. Однако обработанные таким образом клетки еще способны представлять белок, если перед добавлением к клеткам расщепить его на небольшие пептиды (длиной 10-15 аминокислот).

Поразительное свойство антиген-представляющей клетки состоит в том, что она может подвергать процессингу и представлять соответствующему Т-хелперу практически любой антиген. Такое отсутствие антигенной специфичности указывает на то, что антигенпредставляющие клетки, видимо, поглощают антиген путем жидкофазного, а не опосредованного рецепторами эндоцитоза (разд. 6.5.7). Если это так, тогда большинство поглощенных и разрушенных белков будут «своими» белками, пептидные фрагменты которых займут связывающие участки многих молекул МНС класса II. Как полагают, для активации Т-хелпера достаточно того, чтобы чужеродные пептиды присоединились к небольшой доле молекул МНС.

18.6.11. Т-хелперы стимулируют пролиферацию Т-лимфоцитов путем секреции интерлейкина-2 [42]

Активация Т-хелпера - сложный процесс, в нем участвуют различные секретируемые белки, которые носят название интерлейкинов и действуют как локальные химические медиаторы. Активация, видимо, начинается с того, что Т-клетка каким-то неизвестным образом побуждает антиген-представляющую клетку секретировать один или несколько интерлейкинов. Наиболее изученный из этих медиаторов интерлейкин-1 (IL- 1). Комбинированное воздействие IL-1 (и, возможно, других интерлейкинов) и связывания антигена, однако, не стимулирует прямо пролиферацию Т-хелперов. Вместо этого оно приводит к стимуляции Т-клеткой ее собственной пролиферации - заставляет Т-клетку секретировать фактор роста, называемый интерлейкином-2 (IL-2), и синтезировать для него рецепторы, которые будут находиться на клеточной поверхности. Именно связывание IL-2 с этими рецепторами стимулирует пролиферацию Т-клетки. Таким путем Т-хелпер может продолжать пролиферировать при участии аутокринного механизма (разд. 12.1.7), после того как он отойдет от поверхности антиген-представляющей

273

Рис. 18-55. Предполагаемая последовательность событий при стимуляции Т-хелперов антигеном, побуждающей эти клетки к пролиферации. Связывание Т-клетки с антигеном на поверхности антиген-представляющей клетки заставляет Т-клеточный рецептор запустить инозитолфосфолипидный сигнальный путь (разд. 12.3.9) (сигнал 1). В результате Т-клетка каким-то образом стимулирует антиген-представляющую клетку (сигнал 2). Тогда антиген-представляющая клетка секретирует интерлейкины, в частности интерлейкин-1 (IL-1), которые способствуют активации Т-клетки (сигнал 3). Активированная Т-клетка синтезирует рецепторы для интер-лейкина-2 (IL-2) и секретирует IL-2; связывание IL-2 с IL-2-рецепторами (сигнал 4) стимулирует рост и деление клетки. После устранения антигена прекращается в конце концов и образование IL-2 и IL- 2-рецепторов; в результате пролиферация клеток останавливается.

клетки (рис. 18-55). Т-хелперы могут также помогать стимулировать пролиферацию любых других Т-клеток, включая цитотоксические Т-клетки, в которых была ранее индуцирована экспрессия рецепторов IL-2. Но, поскольку экспрессия рецепторов IL-2 строго зависит от стимуляции антигеном, это приводит к пролиферации не всех Т-клеток, а только тех, которые уже встретились с антигеном.

Стоило лишь выявить необходимые для пролиферации Т-клеток условия, как появилась возможность получать неограниченно пролиферирующие антиген-специфические линии Т-клеток в культуре путем непрерывного добавления IL-2 и периодической стимуляции клеток антигеном с целью поддерживать экспрессию рецепторов IL-2. Из таких линий можно было затем выделять одиночные клетки и получать клоны Т- клеток. Как мы уже видели, такие клоны сыграли решающую роль в исследовании Т-клеток. Например, они позволили выделить Т-клеточные рецепторы и их гены; кроме того, они широко использовались для изучения механизмов активации Т-клеток и роли Т-хелперов в стимуляции ответов других лимфоцитов.

18.6.12. Т-хелперы необходимы большинству В-лимфоцитов для ответа на антиген [43]

Т-хелперы нужны для выработки В-клетками антител к большинству антигенов. Это было впервые установлено в середине 60-х годов в экспериментах, в которых облученным мышам вместе с антигеном вводили клетки тимуса или костного мозга. Мыши, получившие только клетки костного мозга или только клетки тимуса, были неспособны вырабатывать антитела; однако, если вводилась смесь тех и других клеток образовывались большие количества антител. Позднее было показано что тимус поставляет Т-клетки, а костный мозг - В-клетки (рис. 18-56) Используя специфический хромосомный маркер для различения введенных Т- и В-клеток, удалось показать, что лимфоциты, секретирующие антитела, - это В-клетки. Был сделан вывод, что Т-клетки, вероятно. помогают В-клеткам реагировать на антиген.

Однако существуют антигены, в том числе многие полисахариды микроорганизмов, которые могут стимулировать пролиферацию созревание В-лимфоцитов без помощи Т-клеток. Такие независимые от Т-клеток антигены - это обычно высокомолекулярные полимеры с повторяющимися идентичными антигенными детерминантами. Много центровое связывание таких антигенов с мембраносвязанными молекулами антител - антигенными рецепторами В-клеток - может давать сигнал, достаточно сильный для прямой активации В-клеток. Имеются данные о том, что клетки, отвечающие таким образом на мультимерные

274

Рис. 18-56. Эксперимент, впервые показавший, что для образования антител животному, вероятно, необходимы как Т-, так и В-клетки. При использованных дозах облучения у мыши погибают те и другие.

антигены, составляют большей частью отдельную субпопуляцию В-клеток, которые эволюционировали в направлении реакции против микробных полисахаридов без помощи Т-клеток.

18.6.13. Т-хелперы помогают активировать В-клетки путем секреции интерлейкинов [44]

Будучи активирован чужеродным антигеном на поверхности специализированной антиген-представляющей клетки, соответствующий Т- хелпер может помогать активации В-клетки путем связывания с тем же самым чужеродным антигеном на ее поверхности. Антигенпредставляющая клетка захватывает и представляет антигены неспецифически (см. выше), но В-клетка, как правило, представляет только тот антиген, который она специфически узнает. Антиген отбирается в результате его присоединения к специфическим мембраносвязанным антителам (антигенным рецепторам) на поверхности В-клетки; он поглощается с помощью опосредованного рецепторами эндоцитоза (разд. 6.5.7), а затем разрушается и вновь появляется на клеточной поверхности в виде пептидов, связанных с гликопротеинами МНС класса II для узнавания Т- хелпером. Таким образом, Т-хелпер узнает на В-клетке, которой он помогает, те же самые комплексы антиген-МНС, что и на антигенпредставляющей клетке, первоначально активировавшей Т-клетку.

Специфический контакт между Т-хелпером и В-клеткой вызывает в цитоплазме хелпера внутреннюю перестройку, в результате которой центросома и аппарат Гольджи ориентируются в направлении В-клетки, как это происходит в цитотоксической Т-клетке при контакте с клеткоймишенью (см. выше, рис. 18-47). В данном случае, однако, ориентация, по-видимому, дает возможность Т-хелперу направлять секрецию интерлейкинов на поверхность В-клетки (а также, возможно, сосредоточивать здесь мембраносвязанные сигнальные молекулы). Эти интерлейкины включают IL-4, который инициирует активацию В-клетки, IL-5, который стимулирует пролиферацию активированных В-клеток, и IL-6, вызывающий созревание активированных В-клеток и превращение их

277

Рис. 18-58. Роль двух вспомогательных рецепторных белков, расположенных на поверхности Т-клеток. Гликопротеин CD8 на цитотоксических Т- клетках связывается, по-видимому, с молекулами МНС класса I, а гликопротеин CD4 на Т-хелперах - с молекулами МНС класса II. Полагают, что в обоих случаях происходит связывание с невариабельными частями молекул МНС. Эти белки межклеточной адгезии помогают стабилизировать связывание Т-клеточных рецепторов с комплексами антиген-МНС на поверхности клетки-мишени, особенно когда связывание слабое. В этих случаях антитела против вспомогательных рецепторных белков CD8 и CD4 ингибируют активацию Т-клеток.

Антитела против CD4 и CD8 широко используются для того, чтобы различать Т-хелперы и цитотоксические Т-клетки соответственно. Вирус, вызывающий СПИД (HIV), инфицирует Т-хелперы, связываясь первоначально с молекулами CD4 на поверхности этих клеток.

или других Т-клеток на антигены. Такая супрессия была впервые продемонстрирована у мышей: их можно было сделать ареактивными (толерантными) по отношению к бараньим эритроцитам путем повторных инъекций больших количеств таких эритроцитов. Когда Т-клетки от толерантных мышей вводили нормальным мышам, те тоже становились специфически толерантными к антигенам бараньих эритроцитов. Это означает, что толерантное состояние обусловлено в данном случае супрессией иммунного ответа Т-клетками. Последующие эксперимента с использованием поверхностных антигенных маркеров показали, что клетки, ответственные за этот эффект, представляют собой специализированный класс Т-лимфоцитов - так называемые Т-супрессоры. Но, как

Таблица 18-4. Вспомогательные гликопротеины на поверхности Т-клеток

* CD означает кластер дифференцировки (cluster of differentiation), поскольку каждый из белков CD был первоначально определен как «антиген дифференцировки» Т-клеток, который узнается рядом моноклональных антител. Их идентификация явилась результатом крупномасштабной совместной работы, в которой было проведено сравнение сотен видов таких антител, полученных во многих лабораториях. Было найдено, что антитела составляют относительно немного групп (или «кластеров»), каждая из которых ; один-единственный белок клеточной поверхности.

279

молекулами МНС, т. е. здесь проявляется рестрикция МНС (разд. 18.6.7), Вскоре после этого эксперименты с пересадкой тимуса показали, что Т- клетки в процессе своего развития в тимусе, по-видимому, «обучаются видеть» антиген в ассоциации с собственными, но не с чужеродными молекулами МНС. Один из экспериментов состоял в следующем. Мышь линии X облучали, чтобы убить все Т-клетки, и вводили ей свежий костный мозг как источник новых Т-клеток. Если затем такой мыши пересадить тимус от мыши линии Y, то в нем будут развиваться Т-клетки линии X. Оказалось, что в большинстве случаев образующиеся зрелые Т-клетки линии X узнают чежеродный антиген в ассоциации с гликопротеинами МНС линии Y, но не линии X. Простейшая интерпретация этих результатов состоит в том, что каким-то образом отбираются и пролиферируют те из развивающихся в тимусе Т-клеток, у которых имеются рецепторы, узнающие антиген в ассоциации с молекулами МНС, экспрессируемыми в тимусе. Из этой гипотезы следует, что в ходе такой положительной селекции происходит отбор цитотоксических клеток на узнавание молекул МНС класса I, а хелперных клеток - на узнавание молекул класса II. В пользу этого говорит и тот факт, что антитела к молекулам МНС класса II специфически блокируют развитие Т-хелперов, а антитела к молекулам класса I-развитие цитотоксических Т-клеток.

Такая интерпретация, однако, не вполне удовлетворительна, так как не объясняет, каким образом происходит селекция в. отсутствие тех чужеродных антигенов, которые позднее будут узнаваться Т-клетками. Одна из возможностей состоит в том, что для выживания и созревания Т- клеток им необходимо слабо связаться с собственными молекулами МНС, и поэтому происходит отбор Т-клеток на слабое узнавание собственных МНС, недостаточное само по себе для активации зрелых Т-клеток; активация могла бы происходить только в том случае, когда объединение чужеродного антигена с собственной молекулой МНС дает структуру, с которой Т-клеточный рецептор может связаться прочно.

Данные в пользу положительной селекции на слабое узнавание собственных МНС в тимусе менее убедительны, чем данные об отрицательной селекции, элиминирующей в тимусе те клетки, которые слишком сильно связываются с собственными молекулами МНС или с собственными МНС в ассоциации с другими собственными молекулами. Наиболее убедительные доказательства того, что сильно реагирующие с собственными МНС Т-клетки элиминируются в тимусе, были получены в генетических исследованиях на мышах. К одному из таких исследований привело случайное наблюдение: один из V-сегментов, кодирующих в геноме вариабельную область β-цепи Т-клеточного рецептора, придает любой экспрессирующей его Т-клетке способность к «сильному» узнаванию специфических молекул МНС класса II (обозначаемых Н-2Е) независимо от D- и J-областей β-цепи и от V-области α-цепи. (Это позволяет предположить, что V-сегменты для Т-клеточных рецепторов могли быть отобраны в ходе эволюции на способность кодировать рецепторы, связывающие молекулы МНС.) Не все линии мышей, однако, экспрессируют Н-2Е. У линий, не имеющих Н-2Е, Т-клетки со специфическим V-сегментом β-цепи выявляются как среди незрелых, так и среди зрелых лимфоцитов тимуса, а у линий, экспрессирующие Н-2Е, - только в популяции незрелых лимфоцитов. По-видимому, Т-клетки такого типа элиминируются еще до их созревания в тимусе.

Эксперименты с трансплантацией тимуса позволяют предполагать, что положительная селекция, с помощью которой объясняют рестрикцию МНС, и отрицательная селекция, придающая толерантность к собственным МНС, - это два независимых процесса. Положительная селекция происходит, видимо, на поверхности собственных эпителиаль-

280

ных клеток тимуса, а отрицательная - вероятно, на поверхности клеток, мигрирующих в тимус из костного мозга. Оба типа клеток экспрессируют на своей поверхности молекулы МНС как класса I, так и класса II.

Механизмы, ответственные за селекцию Т-клеток в тимусе, неизвестны. Положительная селекция происходит, возможно, через посредство сигналов для роста или выживания, которым эпителий тимуса снабжает слабо связывающие Т-клетки. В случае отрицательной селекции клетки, происходящие из костного мозга, могут действовать как «извращенные» антиген-представляющие клетки, которые не активируют, а убивают любую узнающую их Т-клетку. Обладающие таким свойством клетки, названные клетками вето, были выявлены в опытах in vitro.

Удивительная особенность развития Т-клеток в тимусе состоит в том, что более 95% клеток погибает, не покидая тимуса. Столь большие потери обусловлены, по-видимому, жесткой селекцией в ходе развития Т-клеток.

18.6.18. Некоторые аллельные формы молекул МНС неэффективны в представлении специфических антигенов Т- клеткам; это зависит от генов иммунного ответа (Ir) [49]

Вотличие от генов МНС класса I, впервые обнаруженных благодаря их влиянию на отторжение трансплантатов, гены МНС класса II были открыты в связи с их ролью в Т-клеточных иммунных ответах на специфические растворимые антигены. Когда животных иммунизировали простым антигеном, некоторые из них давали очень сильный Т-клеточный ответ, другие же вообще не реагировали. Генетические исследования показали, что способность отвечать на данный антиген контролируется одним геном-геном иммунного ответа (Ir); ответы на разные антигены часто определялись разными генами Ir. Первыми были картированы гены Ir, контролирующие ответ Т-хелперов на антиген, они составили локусы МНС класса П. Гены Ir, контролирующие ответ цитотоксических клеток на антиген, были позднее картированы в области тех или иных локусов МНС класса I.

Эти наблюдения казались в высшей степени загадочными, пока не была открыта решающая роль гликопротеинов МНС в представлении антигенов Т-клеткам. Теперь их можно объяснить, просто предполагая, что у особей, генетически «не отвечающих» на какой-либо простой антиген (обычно с одной антигенной детерминантой), нет такой молекулы МНС, которая могла бы связать антигенную детерминанту и эффективно представить ее соответствующей Т-клетке. Это предположение получило сильную поддержку в результате исследований in vitro, показавших, что очищенные молекулы МНС класса II «отвечающего» животного могут связать соответствующий антигенный пептид, а генетически «не отвечающего» - не могут. В дальнейших исследованиях было установлено, что у молекул класса II имеется лишь один антиген-связывающий

участок (как и у молекул МНС класса I-см. рис. 18-57), который может связывать весьма разнообразные пептиды со средней константой сродства

(Ка) около 106 л/моль (∆G = — 8,5 ккал/моль, что эквивалентно энергии образования примерно восьми водородных связей; см. разд. 3.1.1). При этом скорость связывания невелика (примерно в 105 раз меньше, чем при типичной реакции антитело-антиген), а будучи связанным, пептид освобождается со временем полужизни более суток. Возможно, что для освобождения пептида необходимо медленное конформационное изменение молекулы МНС.

Внекоторых случаях генетической неспособности к ответу на специфические антигены действует, по-видимому, иной механизм. Определенные комбинации собственных молекул МНС с чужеродными пепти-