Биологически активные вещества в биотехнологии

O

NH C CHCl2 O2N CH CH CH2OH

OH

левомицетин

Метод основан на щелочном гидролизе левомицетина и выделении основания левомицетина желтого цвета.

К 0,1 г левомицетина добавить 2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и нагревать 1 2 минуты, появляется желтое окрашивание, переходящее в красно-оранжевое.

Указания к составлению отчета: Выписать формулы антибио-

тиков, описать методыидентификациии наблюдаемые феномены.

Вопросы для самостоятельной работы к разделу «Углеводы, липиды, низкомолекулярные биорегуляторы»

1.Какие свойства глюкозы положены в основу метода ее определения?

2.Почему для определения сахарозы необходим ее гидролиз?

3.Какие органические соединения, кроме углеводов, находятся в яблоке?

4.Какие микроорганизмы являются наиболее распространенными продуцентами антибиотиков?

5.Какие группы антибиотиков вы знаете кроме перечисленных в работе?

6.Почему реакция Троммера не является специфичной для глюкозы?

7.Как вы думаете, можно ли применять реакцию Троммера для определения глюкозы в крови? Почему?

8.Напишите реакцию окисления глюкозы до глюкуроновой кислоты.

9.Крахмал, гликоген и целлюлоза являются полимерами глюкозы. Будет ли синее окрашивание с йодом у гликогена и целлюлозы? Почему?

11

10.Почему жиры нерастворимы в воде и растворимы в неполярных органических растворителях?

11.На чем основано эмульгирование жиров? Какими свойствами должны обладать эмульгаторы?

12.Какие эмульгаторы существуют в организме? Их функции.

13.Почему непредельные жирные кислоты должны поступать

ворганизм с пищей?

14.На чем основано омыление жиров? Напишите уравнение химической реакции омыления триацилглицерида, содержащего 1 остаток стеариновой кислоты и 2 остатка линоленовой кислоты.

15.Чем отличается гидролиз и гидрирование жиров? Напишите уравнения химической реакции гидролиза и гидрирования триацилглицерида, содержащего 1 остаток пальмитиновой кислоты и 2 остатка арахидоновой кислоты.

РАЗДЕЛ II. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

Лабораторная работа № 3 КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА КОМПОНЕНТЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Цель работы: формирование навыков исследования состава нуклеиновых кислот с помощью качественного определения компонентов, образующихся в результате гидролиза нуклеопротеидов.

Для изучения состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей в присутствии серной кислоты. При непродолжительном гидролизе нуклеопротеиды распадаются на белок и нуклеиновые кислоты. При продолжительном гидролизе наступает полный распад нуклеопротеидов. С помощью специальных реакций можно открыть в гидролизате составные части нуклеопротеидов. Биуретовой реакцией устанавливают наличие полипептидов. Пуриновые основания открывают по образованию осадка серебряных солей, фосфорную кислоту – по реакции с молибдатом аммония, а пентозу – пробой Троммера.

Исследуемый материал: пекарские дрожжи.

12

Реактивы:

1.10%-ный раствор серной кислоты.

2.Аммиак концентрированный.

3.2%-ный аммиачный раствор нитрата серебра (к 2%-ному раствору нитрата серебра добавляют концентрированный раствор аммиака до растворения осадка).

4.10%-ный раствор NaOH.

5.7%-ный раствор CuSO4.

6.1%-ный раствор CuSO4.

7.Молибдат аммония в азотной кислоте (7,5 г молибдата аммония растворяют в 100 мл воды и добавляют 100 мл 32%-ного раствора азотной кислоты; полное растворение молибдата аммония происходит после добавления азотной кислоты).

8.1%-ныйраствор аскорбиновойкислоты на1 М раствореHCl.

Оборудование:

1. Большая пробирка или круглодонная колба с пробкой,

вкоторую вставлена длинная стеклянная трубка.

2.Песчаная баня.

3.Штатив с пробирками.

4.Пипетки.

5.Индикаторная бумага.

Ход работы: Помещают 1 г пекарских дрожжей в большую пробирку или круглодонную колбу, добавляют 20 мл 10%-ного раствора серной кислоты и 20 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят под тягой в течение часа. После прекращения кипячения охлаждают, фильтруют. С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов.

1. Серебряная проба на пуриновые основания. Метод осно-

ван на способности пуриновых оснований с аммиачным раствором нитрата серебра образовывать осадок серебряных солей пуриновых оснований, окрашенных в светло-коричневый цвет.

13

Нейтрализуют 10 капель гидролизата 1 каплей концентрированного аммиака и добавляют 5 капель 2%-ного аммиачного раствора нитрата серебра. При стоянии через 3 5 минут выпадает небольшой бурыйосадок серебряных производных пуриновыхоснований.

2. Проба Троммера на пентозы. Метод основан на окислении альдегидной группы рибозы и дезоксирибозы до карбоксильной, при этом гидроксид меди (II) восстанавливается в гидроксид или оксид меди (I) и выпадает восадок.

CuSO4 + 2NaOH → Na2SO4 + Cu(OH)2

2CuOH → H2O + Cu2O↓

К 10 каплям гидролизата добавляют 5 капель 10%-ного раствора NaOH до щелочной среды и добавляют по каплям 7%-ный раствор сульфата меди CuSO4 до появления голубой мути, далее пробирку нагревают до кипения, при этом выпадает желтый осадок CuOH или образуется осадок оксида меди (I) Cu2O красного цвета.

Внимание! Избыток CuSO4 мешает реакции, так как образующийсяпринагреванииCu(OH)2 даетоксидмеди(II) CuO черногоцвета.

3. Молибденовая проба на фосфорную кислоту. Метод ос-

нован на обнаружении фосфорной кислоты по реакции с молибдатом аммония, в результате которой образуется фосфомолибдено-

14

вый комплекс, который, в свою очередь, под действием восстановителей (аскорбиновая кислота) переходит в молибденовую синь.

H3PO4 + 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 → (NH4)3(PO4·12MoO3) + + 21NH4NO3 + 12H2O

Берут 10 капель гидролизата, добавляют 10 капель раствора молибдата аммония, перемешивают содержимое встряхиванием и наливают 10 капель раствора аскорбиновойкислоты. Вновь перемешивают

иоставляютстоять до развития специфического окрашивания.

4.Биуретовая реакция на белок. К 5 каплям гидролизата до-

бавляют 10 капель 10%-ного раствора NaOH до щелочной среды

(проверить рН) и прибавляют 1 каплю 1%-ного раствора CuSO4. В пробиркенаблюдаетсяхарактерное сине-фиолетовоеокрашивание.

Указания к составлению отчета: При составлении отчета написать схему полного распада нуклеопротеидов, химические формулы нуклеотидов и их компонентов.

Вопросы для самостоятельной работы

кразделу «Нуклеиновые кислоты»

1.Какие белки входят в состав нуклеопротеидов, и в чем состоит их особенность?

2.Какие типы нуклеиновых кислот вы знаете, и какова их биологическая роль?

3.Какие углеводы и азотистые основания входят в состав ДНК

иРНК?

4.Напишите формулу динуклеотида, образованного за счет 3’, 5’-фосфодиэфирной связи.

5.Какие ферменты расщепляют нуклеиновые кислоты?

6.Напишите параллельную цепь ДНК для участка: ААТЦЦГТТАТГГ. Укажите триплеты.

7.Напишите последовательность цепи мРНК, синтезированной при использовании в качестве матрицы участка ДНК: ЦЦТГАТАЦЦТГА.

8.Напишите уравнение реакции гидролиза мононуклеотида, образованного рибозой, аденином и остатком фосфорной кислоты.

15

РАЗДЕЛ III. АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ

Лабораторная работа № 4 ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ

Цель работы: овладеть методом разделения и идентификации аминокислот с помощью радиальной распределительной хроматографии на бумаге.

Для изучения аминокислотного состава гидролизатов очищенных белков широко применяют распределительную хроматографию на бумаге – простой, доступный и весьма эффективный метод определения аминокислот.

Метод основан на разной скорости передвижения аминокислот по бумаге в зависимости от коэффициента распределения их между неподвижной (бумага) и подвижной (водно-органический растворитель) фазами хроматографической системы. Водно-органический растворитель, передвигаясь под действием капиллярных сил, одновременно увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты, перемещающиеся с различной скоростью. Скорость перемещения зависит от химического строения аминокислот, которое определяет их способность распределятся между подвижной и неподвижной фазами. Если фазовое равновесие для аминокислоты сдвинуто в сторону жидкой фазы, то она будет перемещаться со скоростью близкой к скорости движения элюента (растворителя). Если, наоборот, аминокислота находится преимущественно в адсорбированном на неподвижной фазе состоянии, то ее скорость будет много меньше скорости движения элюента. Расположение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления хроматограммы. Для этого высушенную бумагу обрабатывают раствором нингидрина и затем нагревают ее в сушильном шкафу до 100 °С, т.е. проводят качественную нингидриновую реакцию на аминокислоты, находящиеся на бумаге. Положение аминокислоты на хроматограмме характеризуется коэффициентом Rf, который определяют по формуле

Rf = a/b,

16

где a – расстояние, пройденное аминокислотой от места старта до середины пятна; b – расстояние, пройденное фронтом растворителя от места старта до финиша.

Чем меньше способность аминокислот адсорбироваться на бумаге (неподвижной фазе) и чем больше их растворимость в вод- но-органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за фронтом растворителя и тем больше величина Rf, и, наоборот, чем больше способность аминокислот адсорбироваться на бумаге и меньше растворимость в подвижной фазе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и тем меньше Rf. Поскольку отдельные аминокислоты в смеси обладают различной скоростью движения, происходит постепенное их разделение.

Величина Rf, кроме химического строения аминокислот и применяемого растворителя, зависит от сорта хроматографической бумаги, ее плотности и окружающей температуры. Коэффициент Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта. Сравнивая величины Rf известных стандартных аминокислот со значениями Rf аминокислот, полученными для исследуемой смеси, можно качественно определить состав смеси. Подвергая пятна аминокислот элюированию (растворению) и колориметрированию, можно определить даже крайне незначительные количества аминокислот (до 0,1 мкг).

Исследуемый материал: стандартные водные растворы аминокислот (в 10 мл воды растворяют 40 60 мг аминокислоты): глутаминовой (или аспарагиновой) кислоты, лейцина, аланина; раствор смеси этих аминокислот.

Реактивы:

1.Растворитель – смесь н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды в соотношении 15:15:10.

2.0,1%-ный спиртовый или 0,2%-ный ацетоновый раствор нингидрина.

Оборудование:

1.Хроматографическая бумага.

2.Карандаш.

17

3.Линейка.

4.Микропипетка или капилляр.

5.Чашка Петри.

6.Сушильный шкаф, нагретый до 100 105 °С.

7.Пульверизатор.

Ход работы: Из хроматографической бумаги вырезают квадрат со сторонами 12 см (больше, чем диаметр чашки Петри) и делят карандашом по диагонали на 4 сектора. В центре карандашом делают круг с радиусом около 1 см – линию старта. В центре делают небольшой вырез. На линию старта в трех секторах микропипеткой наносят капли трех стандартных растворов аминокислот, а в четвертом секторе наносят каплю исследуемой смеси аминокислот. Сектора подписывают карандашом. Квадрат подсушивают на воздухе. В центр квадрата вставляют бумажный фитилек высотой 2 см.

На дно чашки Петри аккуратно наливают 10 мл растворителя, бумажный квадрат накладывают на края чашки Петри так, чтобы фитилек касался растворителя. Чашку Петри закрывают крышкой, желательно равной по диаметру, и оставляют при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не дойдет до краев чашки. Затем снимают крышку чашки Петри, отмечают карандашом фронт растворителя во всех четырех секторах, и хроматограмму сушат в сухожаровом шкафу 5 10 минут для фиксации аминокислот и испарения растворителя. Растворитель из чашки Петри сливают в отведенную для этого склянку.

Далее хроматограмму осторожно опрыскивают из пульверизатора раствором нингидрина в вытяжном шкафу. Снова сушат в сухожаровом шкафу для прохождения нингидриновой реакции и проявления отдельных пятен аминокислот в каждом секторе. Для смеси аминокислот наблюдается несколько пятен.

Указания к составлению отчета: Нарисуйте или приклейте в тетрадь хроматограмму. Проведите расчеты коэффициента Rf для всех полос на хроматограмме. На основании значений коэффициента Rf сделайте вывод о качественном составе исследованной смеси аминокислот.

18

Лабораторная работа № 5 КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Цель работы: формирование умения анализировать аминокислотный состав белка и приобретение навыков проведения качественных реакций на белки и отдельные аминокислоты.

При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции. Образование их обусловлено присутствием в молекуле белка той или иной аминокислоты, имеющей в боковом радикале определенную химическую группировку. Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, содержащим те же химические группировки, поэтому для установления наличия белка недостаточно проведения какой-либо одной реакции.

Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность установить белковую природу вещества и доказать присутствие некоторых аминокислот в различных природных белках. На основании цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот.

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови, 1%-ный раствор яичного белка (белок одного куриного яйца растворяют в 20-кратномобъеме дистиллированнойводы, фильтруют черезмарлю).

Реактивы:

1.10%-ный раствор NaOH.

2.1%-ный раствор CuSO4.

3.0,1%-ный водный раствор нингидрина.

4.Концентрированная азотная кислота.

5.Ледяная уксусная кислота.

6.Концентрированная серная кислота.

7.5%-ный раствор ацетата свинца.

Оборудование:

1.Штатив с пробирками.

2.Пипетки.

3.Песчаная баня или спиртовка.

19

Ход работы:

1. Биуретовая реакция на пептидную группу. Метод осно-

ван на способности пептидных групп образовывать в щелочной среде с ионами Cu2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке. В сильно щелочной среде пептидные группы белка переходят в енольную форму, в которой и взаимодействуют с ионом Cu2+, образуя окрашенный биуретовый комплекс. Ковалентные связи этого комплекса образованы за счет енольного гидроксила, а координационные – за счет атомов азота амино- и иминогрупп, имеющих неподеленные электронные пары:

CH2

SH

В пробирку вносят 5 капель исследуемого раствора и прибавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-ного раствора CuSO4, в пробирке появляется сине-фиолетовое окрашивание.

Нельзя добавлять избыток сульфата меди (II), так как синий осадок гидроксида меди (II) маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

Биуретовая реакция положительна с пептидами, имеющими не менее двух пептидных связей. С ди- и трипептидами она неустойчива. Кроме белков биуретовую реакцию способны давать вещест-

20