Микробиология и биотехнология

– осадок – скудный или обильный, рыхлый, плотный, хлопьевидный, зернистый, слизистый.

Занятие 1

Содержание. Просмотр чашек Петри, пробирок, засеянных различными способами на твердую питательную среду, и описание культуральных и морфологических признаков.

Задание:

1.Описать рост колоний на твердых питательных средах: чашки Петри, рост микроорганизмов по штриху, в столбике.

2.Изучить морфологию клеток описанных колоний, приготовить препараты.

3.Просмотреть препараты под микроскопом и зарисовать микроорганизмы.

Материалы и оборудование: микроскоп и осветитель, коробка с оборудованием, чашки Петри и пробирки, засеянные на предыдущем занятии, штативы, кристаллизатор с мостиком, спиртовки, спички; демонстрационный материал особенностей роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

Занятие 2

Содержание. Продолжение работы по описанию культурных и морфологических признаков роста микроорганизмов на плотных средах.

Задание:

1.Закончить описание колоний и изучение морфологии микроорганизмов на плотных средах.

2.Приготовить жидкие питательные среды (натуральные и синтетические). Простерилизовать их.

3.Засеять пробирки микрофлорой, подписать их и поставить в термостат на проращивание.

Материалы и оборудование: те же, что и на предыдущем занятии; а также исходный материал для засева, реактивы для жидких сред, электрические плитки; автоклав.

31

Занятие 3

Содержание. Описание роста микроорганизмов на жидких средах.

Задание:

1.Просмотреть пробирки с культурами микроорганизмов, выросших на жидких средах и описать особенности их роста.

2.Приготовить твердую питательную среду МПА, простерилизовать ее.

3.Разлить в четыре стерильные пробирки на ½ ее высоты.

4.В две пробирки с МПА посев провести уколом, в две другие (после охлаждения до 48–50 ºС) внести петлей исследуемую культуру, тщательно перемешать и дать агару застыть. Поставить пробирки для проращивание культуры в термостат.

Материалы и оборудование: сухой питательный агар, ве-

сы с разновесом, шпатель, штативы, пробирки, электрическая плитка, конические колбочки, дистиллированная вода, микробиологическая петля и игла.

Тема 5. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ

Краткие теоретические сведения

Характеристика физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов необходима для их описания и идентификации. С этой целью широко используют некоторые особенности обмена веществ микроорганизмов, выявляемые по способности изучаемого вида расти на различных питательных средах и вызывать определенные превращения веществ, входящих в состав сред. Чаще всего учитывают использование различных соединений углерода, азота, отношение к кислороду, способность продуцировать антибиотические вещества и проявлять ферментативную активность в отношении различных субстратов.

Отношение к кислороду. По отношению к кислороду микроорганизмы делят на четыре большие группы: облигатные аэ-

32

робы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы. Для описания микроорганизмов и дальнейшей идентификации ограничиваются наблюдением роста изучаемого организма после посева уколом в агаризованную среду и в расплавленную агаризованную среду. Строгие аэробы растут на поверхности среды и в самом верхнем ее слое, микроаэрофилы – на некотором расстоянии от поверхности среды, факультативные анаэробы развиваются по всей толще среды, облигатные анаэробы – только в глубине среды.

Использование соединений углерода. Микроорганизмы ха-

рактеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы и спирты (моно, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды) в качестве единственных источников углерода и энергии. Для идентификации большинства гетеротрофных микроорганизмов необходимо определить, какие углеводы и спирты обеспечивают рост изучаемого организма и какими изменениями среды он сопровождается. Рост на средах с различными соединениями (углеводами и спиртами) может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов и газов.

Образование кислот регистрируют по изменению активной кислотности (рН) среды, образование газа – по появлению на поверхности среды пены и вытеснению среды из поплавка.

Протеолитическая активность. Протеазы катализируют расщепление белков на фрагменты: поли- и олигопептиды. Протеазы выделяются различными видами бацилл, актиполицетов, мицелиальных грибов и других групп микроорганизмов. Активность внеклеточных протеаз определяют, используя в качестве субстрата желатину или другие белки.

Занятие 1

Содержание. Определение отношения микроорганизмов к кислороду.

Задание:

1. Просмотреть пробирки, заранее засеянные культурой микроорганизмов.

33

2.Отметить рост и его интенсивность по уколу и в толщине среды. В соответствии с этим охарактеризовать отношение исследуемого организма к кислороду, используя рисунки.

3.Приготовить среды для определения отношения микроорганизмов к источникам углерода (сахара, спирта). Для этого углеводы и спирты добавить к основному фону среды в количестве 1 %. Основной фон среды готовить на водопроводной воде

по рецептуре: 0,5 % пептона, 0,1 % K2HPO4. В качестве индикатора для определения рН среды используют бромкрезолпурпур или бромтимолблау – из расчета 2 мл 16%-ного спиртового раствора на 1 л среды. Для обнаружения газа в среду опускают поплавки (трубочки d = 5–7 мм, длиной – 35–45 мм и запаянные с одного конца).

4.Добавить в приготовленную среду (основной фон) исследуемый источник углерода. Измерить рН.

5.Разлить среду по пробиркам, подписать их и записать в лабораторную тетрадь значения рН среды, цвет используемого индикатора и источник углерода.

6.Засеять среду исследуемым микроорганизмом и поставить пробирки с культурой в термостат.

Материалы и оборудование: источник углерода (спирт,

сахар, органические кислоты). Реактивы для сред (пептон,

K2HPO4), индикаторы (бромтимолблау или бромкрезолпурпур), весы с разновесом, штативы, конические колбы на 250 мл, пробирки с поплавками (см. рис. 6). Культуры микроорганизмов для инокуляции. Демонстрационный материал.

Занятие 2

Содержание. Протеолитическая активность. Протеолиз желатины.

Задание:

1.Просмотреть засеянные ранее пробирки с культурой на среде с углеродами, спиртами.

2.Отметить рост на средах и отношение микроорганизмов

кисточнику углерода по изменению цвета индикатора, рН, выделению газа.

34

3.На основании полученных данных сделать заключение о том, какие источники углерода (спирты, кислоты, углеводы) используют изучаемые микроорганизмы.

4.Полученные результаты занести в таблицу.

Показатели роста исследуемого микроорганизма на средах с источником углерода

5.Приготовить мясопептонную желатину (МПЖ): к 100 мл (МПЖ) добавить 10–15 г желатины, оставить на 20–30 мин, чтобы она набухла, нагреть на водяной бане до полного растворения желатины и разлить в пробирки по 8–10 мл. Стерилизовать при 0,5 атм. 15 мин.

6.Засеять приготовленную среду после ее застывания исследуемой культурой микроорганизмов. Посев произвести уколом в столбик. Поставить в термостат засеянные пробирки на 7–10 суток при комнатной температуре.

Материалы и оборудование: весы с разновесом, сухой пи-

тательный агар (МПА), желатина, колбочки на 250 мл, штативы, пробирки, игла для посева уколом, электроплитка с закрытой спиралью, водяная баня, исходный материал для заражения.

Занятие 3

Содержание. Продолжение работы по протеолизу желатины.

Задание:

1. Просмотреть ранее засеянные пробирки с МПЖ.

35

2.Отметить разжижение желатины или его отсутствие визуально.

3.Указать интенсивность и форму разжижения.

4.Записать результаты в тетрадь и зарисовать форму разжижения МПЖ.

5.Просмотреть культуру, разжиженную желатину, под микроскопом, сделав предварительно мазки.

Материалы и оборудование: пробирки с культурой, со-

держащей протеолитические ферменты (коллагеназы), коробка с оборудованием, микроскоп с осветителем, спиртовка, спички, кристаллизатор с мостиком, штативы; демонстрационный материал (схема разжижжения желатины микроорганизмами при посеве уколом).

Занятие 4

Содержание. Зачет.

Зачет включает в себя проверку лабораторных тетрадей и устное обсуждение результатов экспериментальных работ.

36

БИОТЕХНОЛОГИЯ

Тема 6. БИОХИМИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА. ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ РАБОТЫ ОЧИСТНЫХ СООРУЖЕНИЙ

Краткие теоретические сведения

Индустриальные методы биохимической очистки основаны на принципе естественного самоочищения. Технические сооружения представляют собой емкости, в которых формируются сообщества микроорганизмов – активный ил аэротенков, биопленка биофильтров.

Анализ качества вод в естественных водоемах и сооружениях биохимической очистки проводят общепринятыми методами контроля, которые подразделяются на химические, микробиологические и гидробиологические. Все три метода исследования воды самостоятельны, но должны применяться одновременно, чтобы получить более полный анализ качества воды.

Методы контроля

Методы химического контроля основаны на качественном и количественном определении основных элементов загрязнения – органических веществ, нефтепродуктов, солей тяжелых металлов, биогенов и др. Однако химический контроль трудоемок и недостаточно оперативен, так как методики проведения анализа громоздки и требуют длительного времени.

Микробиологические методы основаны на экологических свойствах микроорганизмов. Их обнаружение, выделение, культивирование и идентификация требуют от исследователя высокого профессионализма и больших навыков.

Методы гидробиологического контроля позволяют быстро оценить качество вод и, что особенно ценно, уловить влияние любых загрязнений по реакции гидробионтов.

При биологической очистке воды задача гидробиологического анализа заключается в том, чтобы по численности индика-

37

торных видов и их физиологическому состоянию в короткий срок дать заключение об эффективности очистки воды, качестве активного ила и его способности к переработке загрязнений.

Последовательный гидробиологический анализ включает в себя следующие этапы: отбор проб, оценка общего характера ила, определение видового состава и физиологических особенностей, населяющих его гидробионтов, количественный их учет, математическая обработка полученных данных и, как результат, заключение о работе очистных сооружений

Отбор проб

Жидкие пробы (сточная вода, активный ил, очищенная вода) зачерпывают, например, ковшом. Пробу доставляют на анализ в неизменном состоянии. Поэтому быстро, до оседания взвеси, пробу переливают в стакан или в широкогорлую банку, заполняя сосуд до половины, и в открытом виде немедленно доставляют в лабораторию. Затем пробу с активным илом тщательно перемешивают, отливают часть в мерный цилиндр на 100 мл для определения объема осевшего ила. Остальную часть пробы используют для визуальной оценки характера ила и микроскопирования.

Анализ осуществляется в течение получаса. При хранении пробы в холодильнике в открытом виде этот срок может быть продлен до 2 ч.

На биологических очистных сооружениях устанавливаются постоянные места и сроки отбора проб, что позволяет обеспечить контроль за ходом очистки во всех основных узлах сооружений. Для выявления технологических нарушений применяют специальные схемы отбора. Пробы обычно отбирают с глубины 3–40 см. Приотборе пробсразных глубин используют батометры.

Характеристика активного ила

Процесс биологической очистки сточных вод протекает под воздействием активного ила. Активный ил представляет собой сложную экосистему, в состав которой входит большое количе-

38

ство представителей микрофлоры и микрофауны. Основу этой системы как по массе, так и по значимости в процессе очистки составляют бактерии, главным образом в виде хлопьевидных скоплений – зоогелей.

С физико-химической точки зрения активный ил представляет собой амфотерный коллоид, имеющий в интервале рН 4–9 отрицательный заряд. Его объем, вязкость, пластичность и другие реологические свойства во многом зависят от влажности ила, которая в аэротенках составляет 99,0–99,9 %.

Содержание воды в активном иле в значительной степени обусловлено его хлопьеобразующей способностью, которая зависит от возраста культуры.

Активный ил имеет сложную структуру. Каждая его клетка окружена биополимерной оболочкой, 3–5 клеток одного вида объединены в клоны, окруженные биополимерным веществом. Клетки, находящиеся внутри клона, и отдельные клоны соединены биополимерными мостиками. Связь клонов между собой менее прочная, чем клеток внутри клона. В процессе аэрации разрыв происходит по межклоновым связям.

Процессы сегрегации и агрегации в активном иле протекают в условиях аэрации непрерывно, благодаря чему устанавливается равновесие в системе, обновляется поверхность контакта, что ускоряет процессы метаболизма. На долю бактерий приходится 15–20 % объема хлопьев, остальное пространство заполнено биополимерным веществом. В биоценозе активного ила присутствуют нитчатые бактерии, гифы водных грибов, дрожжи, бесцветные жгутиконосцы, саркодовые (голые и раковинные), инфузории. При продленной аэрации, когда осуществляется глубокая очистка, появляются коловратки, водные черви и в небольших количествах многоклеточные беспозвоночные (тихоходка, водные клещи, гастротрихи).

39

Тема 7. ГИДРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОГО ИЛА

Краткие теоретические сведения

Гидробиологический анализ применяется для контроля биохимической очистки сточных вод в аэробных очистных сооружениях. Биологические индикаторы активного ила тесно связаны с технологическими параметрами очистки сточных вод, поэтому метод гидробиологического контроля, основанный на экологических свойствах организмов, позволяет быстро оценить качество очистки, что невозможно достичь стандартными методами химического анализа.

Для оценки качества биохимической сточных вод используют индикаторные организмы, указывающие на неудовлетворительную или хорошую работу очистного сооружения.

Занятие 1

Содержание. Определение общей характеристики активного ила.

Задание:

1.Отобрать пробу ила из аэротенка.

2.Определить визуально общие свойства активного ила при просмотре встакане на100 мл, учитывая следующие показатели:

– скорость оседания хлопьев (быстро, медленно);

– цвет (бурый, рыжеватый, черный, белесый и т.д.);

– характер воды над осевшим илом (прозрачная, мутная окрашенная, опалесцирующая);

– запах (гнилостный, сероводородный, характерный для определенных химических веществ);

– состояние ила, например его всплывание при отстаивании; другие показатели (следы нефти, детергентов).

3.Записать полученные данные в виде таблицы в лабораторную тетрадь.

Материалы и оборудование: проба с активным илом, стек-

лянные стаканчики на 100 мл, стеклянная палочка.

40