Микробиология и биотехнология

Все объективы делятся на сухие и иммерсионные, или погруженные. Сухим называется такой объектив, между фронтальной линзой которого и рассматриваемым препаратом находится воздух. При этом ввиду разницы показателя преломления стекла и воздуха часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя. Объективы сухой системы имеют обычно большое фокусное расстояние и дают малое (×8) или среднее (×40) увеличение.

Иммерсионными, или погруженными, называются объективы между фронтальной линзой которых и препаратом помещается жидкая среда с показателем преломления, близким к показателю преломления света.

В качестве иммерсионной среды используют обычно кедровое масло. При этом между фронтальной линзой объектива и препаратом устанавливается гомогенная среда с одинаковым показателем преломления. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, создавая условия наилучшего освещения препарата.

Окуляры состоят из двух плосковыпуклых линз, вмонтированных в металлическую оправу.

Благодаря объективу и окуляру получают изображение предмета в микроскопе дважды увеличенное, мнимое, обратное по отношению к препарату.

Увеличение. Общее увеличение микроскопа равно произведению объектива (Vоб) на увеличение окуляра (Vок):

V=Vоб · Vок.

Например, если объектив дает увеличение ×90, а окуляр ×15, то общее увеличение равно 1350.

Отчетливость получаемого изображения определяется разрешающей способностью микроскопа, которая зависит от длины волны используемого света и числовой апертуры оптической системы микроскопа. Разрешающая способность связана обратной связью с пределом разрешения d-минимальным расстоянием между двумя точками, при котором еще можно различить каждую из них. Пределразрешения определяется по формуле

11

d = L / A1 + A2,

где d – минимальное расстояние между двумя точками; А1 – числовая апертура объектива; А1 – числовая апертура конденсора; L – длина волны используемого света. Числовая апертура определяется произведением синуса половины (u) отвесного

тель преломления воздуха равен 1, а угол и не может быть больше 90º (т.е. sin и ≤ 1).

Основные приемы микроскопирования

Перед началом работы установить микроскоп и осветитель (или лампу). На плоском зеркале микроскопа поместить кружок белой бумаги и перемещать патрон с лампой внутри корпуса осветителя до тех пор, пока нить накаливания лампы не будет видна на всей площади зеркала. На предметный столик поместить препарат. После этого снять бумажку с зеркала и направить световой зайчик на препарат, открыв предварительно диафрагму осветителя. Перемещая препарат в поле зрения микроскопа, закрыть диафрагму осветителя и полностью открыть диафрагму конденсора. Медленно перемещать конденсор до тех пор, пока в поле зрения не появится четкое изображение диафрагмы осветителя – белое пятно круглой формы. Вращением зеркала установить белое пятно в центре поля зрения. Приоткрыть диафрагму осветителя до тех пор, пока пятно не займет все поле зрения.

12

Снять окуляр. В глубине тубуса виден светящийся кружок – зрачок объектива, который равномерно залит светом. Затем медленно закрывать диафрагму конденсора до тех пор, пока она не появится в зрачке объектива. После этого вставить окуляр и установить нужное расстояние между объективом и препаратом путем вращения макрометрического винта. При малом увеличении (объектив ×8, окуляр ×7 или ×10) тубус устанавливается под контролем глаза на расстоянии около 5 мм от препарата. Дальнейшая фокусировка обеспечивается путем поднятия тубуса вращением макрометрического и микрометрических винтов. При большом увеличении тубус под контролем глаза устанавливается почти до соприкосновения с препаратом, а затем тубус медленно поднимается, фокусируясь на препарате.

После работы удалить иммерсионное масло с объектива, для чего протереть его ватным тампоном, смоченным бензином. После окончания работы все объективы протереть специальной салфеткой, а сам микроскоп накрыть колпаком.

После усвоения основных приемов микроскопирования настроить микроскоп для наблюдения объектов в отраженном и проходящем свете и просмотреть препараты живых и инактивированных бактериальных культур с помощью сухой и иммерсионной систем микроскопа.

Занятие 1

Содержание. Оборудование микробиологической лаборатории. Подготовка рабочего места. Знакомство с устройством биологического микроскопа. Изучение основных приемов микроскопирования.

Задание:

1.Ознакомиться с материалами и оборудованием микробиологической лаборатории.

2.Изучить устройство биологического микроскопа и основные приемы микроскопирования.

Материалы и оборудование: микроскоп и осветитель, ко-

робка для микробиологических работ.

13

Тема 2. МОРФОЛОГИЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ ГРУПП МИКРООРГАНИЗМОВ.

МИКРОСКОПИЯ

Краткие теоретические сведения

Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм = 0,001 мм = 10–3 мм), возможно только с помощью специальных приборов – микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия ) и десятки тысяч ( электронная микроскопия ) раз.

Приготовление препаратов живых и инактивированных микроорганизмов

Перед началом работы зажигают спиртовку. Пробирку с культурой (не открывая пробку) помещают между большим и указательным пальцами левой руки, поддерживая ее средним пальцем так, чтобы она находилась в наклонном положении (рис. 3). В правую руку берут держатель бактериологической петли, прокаливают петлю в пламени спиртовки. Обжигают в пламени спиртовки и часть держателя, примыкающую к петле. Держатель берут при помощи большого и указательного пальца правой руки и поддерживают средним пальцем как писчее перо. Затем мизинцем правой руки плотно захватывают ватную пробку и, зажав ее между мизинцем и ладонью, вращательным движением вытаскивают пробку из пробирки и держат ее таким образом, чтобы она внутренней поверхностью не касалась окружающих предметов. После этого обжигают края пробирки в пламени спиртовки. Прокаленную петлю вводят в зону пламени спиртовки, дают ей остыть, прикасаясь к внутренней поверхности стенки пробирки, вводят остывшую петлю в пробирку и берут немного микробной массы. После этого вновь обжигают края пробирки и закрывают пробирку пробкой. Взятый петлей материал используют для приготовления препарата или посева.

14

После этого снова обжигают петлю в пламени спиртовки для уничтожения оставшихся на ней микроорганизмов.

Для определения формы микробов, способности их к спорообразованию и подвижности исследования бактериальных клеток производят в живом и инактивированном состоянии. С этой целью готовят препараты.

Для наблюдения подвижности микроорганизмов готовят препараты: раздавленную и висячую капли.

Раздавленная капля. На чистое предметное стекло наносят небольшую каплю водопроводной воды. Дистиллированную воду брать не рекомендуется, так как в ней отсутствует необходимая для микробов концентрация солей, что может вызвать изменение формы клеток, потерю ими способности к движению и т. д. В каплю воды вносят иглой небольшое количество исследуемых микробов, тщательно размешивают и полученную слегка опалесцирующую суспензию покрывают покровным стеклом.

Висячая капля. Наносят каплю суспензии микробов петлей на покровное стекло, перевертывают его так, чтобы капля висела на нижней стороне стекла, и накладывают его на предметное стекло с углублением посредине. Капля должна свободно висеть в углублении предметного стекла, не касаясь его краев и дна. Края углубления предметного стекла предварительно необходимо смазать вазелином для герметичного заключения капли во влажной камере.

Прижизненная окраска. При работе с раздавленной каплей для лучшей видимости микробов жидкость можно слегка подкрасить, введя под покровное стекло небольшую каплю раствора метиленовой сини или нейтрального красного. В результате бактерии приобретают синюю или красную окраску, лучше видны, и поэтому легче определить их форму.

Фиксацией и окраской препаратов пользуются в тех случаях, если необходимо рассмотреть некоторые детали строения бактериальных клеток (капсулы, споры, включения, жгутики), вести подсчет микробов и т.п.

15

Рис. 3. Схема приготовления микроскопического препарата

Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на сухое обезжиренное предметное стекло стерильной пипеткой наносят каплю стерильной воды. Стерильной петлей берут небольшое количество бактериальной массы и вносят ее в каплю воды на предметном стекле, перемешивая до помутнения капли. После этого бактериологической петлей равномерно распределяют бактериальную взвесь по поверхности предметного стекла тонким слоем. Полученный мазок высушивают при комнатной температуре, а затем сухой препарат проводят 3–4 раза над пламенем спиртовки мазком вверх для фиксации бактериологического материала. При фиксации микроорганизмы убиваются, происходит их прикрепление к стеклу и повышается их восприимчивость к красителям.

16

Фиксированный мазок кладут на стеклянный мостик над ванночкой и на него наливают краситель. После 1–2-минутной экспозиции краску сливают, препарат осторожно промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не становится бесцветной. После высушивания при комнатной температуре препарат готов к микроскопированию.

Окраска по Грамму

Метод окраски по Грамму служит важным диагностическим признаком при определении некоторых микроорганизмов. Способность бактерий окрашиваться красителями триметилфенолового ряда связана с химическим составом клеточной стенки, основу которой составляет у грамположительных бактерий мурииновый комплекс. Мурииновый комплекс – это ацетилглюкозамин и ацетилмурамовая кислота, соединенные с пиптидами. У грамотрицательных бактерий мурииновый комплекс составляет лишь 10 %. Грамположительные бактерии удерживают комплекс генциан-фиолетового с йодом при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет. Грамотрицательные – не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином бактерии приобретают розовую окраску.

Для окраски по Грамму рекомендуется пользоваться молодыми культурами микробов.

Следует готовить тонкий мазок, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образовались скопления.

Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем спиртовки и окрашивают в течение 1–2 мин карбоновым генциановым или кристаллическим фиолетовым. Перед нанесением красителя рекомендуется покрывать мазок плоской фильтровальной бумагой для получения более чистых препаратов. Затем краситель сливают и, не промывая мазок водой, обрабатывают его 1–2 мин раствором Люголя до почернения. Раствор

17

Люголя сливают и препарат обесцвечивают 0,5–1,0 мин 96%-ным этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1–2 мин водным фуксином. Избыток красителя сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Красящиеся по Граму бактерии приобретают синефиолетовую окраску (грамположительные), некрасящиеся (грамотрицательные) имеют розово-красный цвет в результате докраски фуксином.

Занятие 1

Содержание. Знакомство с морфологией некоторых микроорганизмов (бактерий, грибов, дрожжей, водорослей) с использованием различных методов микроскопии.

Задание:

1.Приготовить препараты различных культур микроорганизмов: раздавленную каплю, висячую каплю, мазок.

2.Просмотреть препараты под микроскопом, используя различные приемы микроскопии.

3.Зарисовать и отметить морфологическую форму микроорганизмов, сочетание клеток, характер движения.

Материалы и оборудование: микроскоп, предметные (про-

стые и с лункой) и покровные стекла, спиртовка, спички, коробка для микробиологических работ, микроорганизмы для просмотра (бактерии, грибы, дрожжи, водоросли) (рис. 4).

Занятие 2

Содержание. Окраска по Грамму.

Задание:

1.Приготовить препараты бактерий иокраситьих по Грамму.

2.Просмотреть подмикроскопом приготовленныепрепараты.

3.Зарисовать и подписать полученные результаты исследо-

ваний.

18

Рис. 4. Морфология бактерий: 1 – микрококки; 2 – диплококки; 3 – сарцина; 4 – стрептококки; 5 – стафилококки;

6– бактерии; 7 – бациллы; 8 – вибрионы; 9 – спириллы; 10 – спирохеты; 11 – нитчатая форма серобактерий; 12 – нитчатая форма железобактерий

Материалы и оборудование: микроскоп, капельницы с во-

дой и красителями (генцианвиолет, фуксин или раствор Люголя), спирт, кристаллизатор с мостиком, штатив, стеклянный стаканчик, спиртовка, спички, микробиологическая коробка с остальными принадлежностями, микроорганизмы для окраски по Грамму.

Тема 3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Краткие теоретические сведения

Правила работы с культурами микроорганизмов. Микро-

организмы выращивают в лаборатории на различных плотных и жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбочки, чашки Петри.

19

По составу среды для культивирования делят на группы: естественные, или натуральные, среды неопределенного состава и синтетические.

Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного и животного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, молоко, вода морей, озер, экстракты, полученные из природных субстратов (мясо, навоз, почва, различные части растений). Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

Натуральные среды имеют сложный непостоянный химический состав и малопригодны для изучения физиологии облика веществ у микроорганизмов. Примерами натуральных сред неопределенного состава, которые используются в лабораторной практике, служат мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенная вытяжка.

К числу натуральных сред неопределенного состава относят и так называемые полусинтетические среды, в состав которых наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Такие среды находят широкое применение в технической микробиологии для получения аминокислот, витаминов и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Примерами таких сред могут служить мясопептонный бульон с глюкозой и фосфорнокислым калием, картофельная среда с глюкозой и пептоном, гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, кукурузный экстракт.

Синтетические среды – это среды, в состав которых входят только определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Они могут быть довольно простыми по составу и иметь относительно большой набор компонентов.

20