Основы современных методов изучения нуклеиновых кислот. (110

(ауторадиограф ически) ограниченноеколичество полос(их количество равно количеству Т в матричном полинуклеотиде). Аналогично проводят копированиевотсутствиедругих суб стратов: - дГ TФ , - дЦTФ или - дTTФ ( - Г -, - Ц- и - Т -систем ы соответственно). В се четыре ионоф ореза проводят в полиакриламидном геле параллельно. П олученные ауторадиограмм ы позволяю тсразунаписать нуклеотидную последовательность, причем чтение ц епи снизу вверх соответствует 5' → 3'-полярности ц епи копии. Н апример, полож ениесамого короткого олигонуклеотида (в" - Т -системе") указываетна то, что следую щ ий за ним по длинеолигонуклеотид заканчивается на Т , т. е. чтопротивполосы, располож еннойвыш е(этополосав - А-системе), следует записать б уквуТ . Т аким ж еоб разом записываю тдалеевпоследовательности б укву А (на основании полож ения следую щ его по длине олигонуклеотида,

дополнительное копирование (после первого этапа) проводят вприсутствии Д Н К-полим еразы, выделенной из б актериоф ага Т 4, которая проявляет 3'- экзонуклеазную активность, т. е. отщ епляетм ононуклеотиды одинзадругим с 3'-конц а. В тож евремя вприсутствиисуб стратовееполимеразная активность во много раз превосходит экзонуклеазную . Т ак, если вреакц ионной см еси присутствует хотя б ы один дезоксириб онуклеозид-5'-триф осф ат (дATФ в" +А-системе"), деградац ия каж дой копии, об разовавш ейся на первой стадии анализа, б удетпроходить вплоть до м еста полож ения А. С м еси параллельно подвергаю т электроф орезу, как и в предыдущ ем случае, и получаю т ауторадиограмм ы, из которых сразу считывается последовательность 5'→ 3'- направление, считывается такж е снизу вверх). И з сравнения ф ореграмм "плю с-" и "минус-систем " делается однозначный вывод о нуклеотидной последовательностивкопиях и, следовательно, вм атричном полинуклеотиде.

П рименимость метода С энгера зависит от возм ож ности получения

сравнениисф ерм ентативным м етодом секвенирования Д Н Кпо С энгеру, этот метод внастоящ ее время все ж е продолж аетиспользоваться и вотдельных случаях почти незам еним . Т ак, метод хим ической деградац ии применяется

32

для секвенирования синтетических олигонуклеотидоввтех случаях, когда это необ ходим о. О соб о "трудные" участки с сильной вторичной структурой не всегда б ывает возмож но секвенировать с пом ощ ью ф ерментативного построения новойц епиД Н Ки тогда использую тданный метод. Кром еэтого, с помощ ью секвенирую щ его гельэлектроф ореза возмож но выявление Д Н К/б елковых взаим одействийпослетого, какисследуем ая Д Н Квком плексе сб елком б ыла подвергнута хим ической м одиф икац ии по М аксам у-Г илб ерту. К некотором у преим ущ еству м етода секвенирования Д Н К химической де-

дидезокситерм инаторам и. Е щ еодно отличием етода секвенирования Д Н Кпо М аксам у-Г илб ерту от метода С энгера заклю чается в том , что его осу- щ ествление мож ет начаться практически с лю б ого сайта узнавания какойниб удь рестрикц ионной эндонуклеазы, присутствую щ его во вставке и поэтом у не треб уется предварительного знания даж е неб ольш ого участка нуклеотидной последовательности, окруж аю щ его данноеместо. В этой связи м етод секвенирования Д Н Кпутем хим ическойдеградац иииногдавыступаетв качестве стартового при выполнении крупном асш таб ных проектов по определению нуклеотидных последовательностей протяж енных ф рагментов Д Н К. В то ж е врем я нельзя не отметить серьезный недостаток м етода секвенирования Д Н К по М аксам у-Г илб ерту, заклю чаю щ ийся в высокой токсичности б ольш инства используем ых реагентов, об ращ ениескоторым и и их дальнейш ая утилизац ия треб ую тсоб лю дения определенных правил.

В основе метода секвенирования Д Н К путем химической деградац ии леж ит ограниченное расщ епление м еченого ф рагм ента Д Н К под действием спец иф ических реагентов. Н епременным условием проведения секвенирования этим методом является наличиеф рагм ента Д Н К, меченного только по одном у конц у. Разделение продуктовдеградац ии по разм еру с пом ощ ью высоковольтного электроф ореза в полиакрилам идном геле высокого разреш ения, способ ного разделять ф рагм енты Д Н К, различаю щ иеся м еж ду соб ой по длине всего на один нуклеотид в достаточно ш ироком

33

Рисунок12. С еквенированиеД Н Кметодом хим ическойдеградац ии.

количество таких м олекул, то, согласно теории вероятности, все основания

нуклеотидовили их комб инац ии проводятотдельныереакц ии ограниченной модиф икац ии и количественного расщ епления. Т аким об разом , врезультате четырех (или иногда трех, пяти или даж е ш ести) типовреакц ий об разуется смесь олигонуклеотидных м олекул, различаю щ ихся по разм еру на один нуклеотид и несущ их на одном из конц овм етку, об ычно радиоактивную . С ледует отметить, что кром е м еченых молекул вреакц ионной смеси б удут представлены, и олигонуклеотидные ф рагм енты, не несущ ие метки, но на этапе радиоавтограф ии они окаж утся невидим ым и и поэтом у для данного метода они какб ы не сущ ествую т. П осле разделения продуктовреакц ии в

34

соседних дорож ках секвенирую щ его денатурирую щ его полиакрилам идного геля и этапа радиоавтограф ии на рентгеновской пленкеб удетвидна лестниц а из полос Д Н К на соседних дорож ках, "чтение" которой позволяет восстановить последовательность нуклеотидов секвенируем ого ф рагм ента Д Н К.

3.3 Авт о мат ическо есеквен ир о ван ие

В последнееврем я ш ироко применяю тся спец иализированныеприб оры для проведения и считывания результатовсеквенирования. И спользование данных приб оровпозволило увеличить качество считывания инф ормац ии с аутограмм ы, атакж езначительнооб легчить сам упроц едуруподготовкиД Н К.

последовательность П ЦР-продукта. Амплиф икац ия определенных ф рагментов Д Н К с помощ ью спец иф ических прайм еров, приводящ ая за короткий промеж утокврем ени кнараб откезначительных количествнуж ных участков Д Н К, явилась альтернативой методу клонирования. П оэтом у удельный вес П ЦР-секвенирования в об щ ем определении нуклеотидных последовательностей различных Д Н К внастоящ ееврем я б ыстро возрастает. П рямое секвенирование ф рагмента Д Н К, полученного в результате ам плиф икац ии, взначительноймересним алопроб лем уош иб очновстроенных Taq Д Н К-полим еразой нуклеотидов, поскольку вэтом случаесеквенируется сразувесь пул полученных вП ЦР м олекул.

Автоматическое секвенирование использует ф луоресц ентные м етки на ддН Т Ф (для каж дого нуклеотида используется свойц вет). Э топозволяетвсем четырем реакц иям (дГ Т Ф , дАТ Ф , дЦТ Ф и дТ Т Ф ) проходить в одной проб ирке. Д ля проведениеавтом атического секвенирования сначала проводят

результата. П оследовательное считывание отличаю щ ихся по ц вету ф ракц ия, даетвозмож ность выстроить последовательность нуклеотидоввсекверуем ом ф рагм енте.

35

Рисунок13. С хем аавтом атическогосеквенирования.

экспрессии является метод молекулярной гиб ридизац иинуклеиновых кислот. О н основан на возмож ности об разования двуц епочечных гиб ридовм еж ду искусственно создаваемым и на основеодноц епочечных последовательностей (риб о- илидезоксириб о-, олигоилиполинуклеотидных) м еченым изонда ми и ком плементарным и им последовательностям и вми ш енях – анализируем ых м олекулах Д Н К или РН К. Зонд м етится какой-либ о реп орт ерной груп п ой: радиоактивным изотопом , ф луорохром ом , ф ерментом , даю щ им окраш енный или лю м инесц ирую щ ий продукти т.д. В ыявляя гиб рид б лагодаря наличию в зонде репортерной группы, исследователь м ож ет оц енить число генов, кодирую щ их определенный вид РН К, определить долю нетранскриб ируем ой Д Н Квгеном е, установить сц еплениеопределенных геновдруг сдругом иих точное располож ение на хром осомах. В ысокая чувствительность, то есть

исследовательской деятельности, но и для диагностики наследственных и инф екц ионных заб олеванийвм едиц ине, ветеринарииирастениеводстве.

4.1 В иды мо лекуля р н о й гибр идиз ац ии

Т ехника б лотинга различна для разных источниковнуклеиновых кислот. Блот по С аузерну (Southern blot) и Н озерн б лот (nothern blot) использую т, соответственно, для извлечения Д Н К или РН К из геля, а В естерн б лотинг – для б елков.

накладываю тна гель, а сверху укладываю тнесколько слоевф ильтровальной

раствор смеченым зондом , вкотором и происходитгиб ридизац ия. П ослеот- м ывки несвязавш ейся радиоактивности результат выявляю т с пом ощ ью радиоавтограф ии или иных способ ов в случае использования нерадиоактивных меток.

37

Рисунок14. С хем аб лотингапоС аузерну.

Н о зерн б ло т инг.

С тандартные условия б лотинга по С аузерну не применим ы кРН К, так как она не связывается с об ычным и нитроц еллю лозным и и нейлоновым и мем б ранам и. Д ля имм об илизац ии РН Квначалеб ыл предлож ен спец иальный вид б ум аги с диазоб ензилоксиметилом (DMB-ц еллю лоза), а затем б ыли найдены условия для нековалентного связывания РН К с нитроц еллю лозой (предварительная денатурац ия РН К дим етилсульф оксидом , ф орм альдегидом идр.) иразраб отаны для этогоподходящ иенейлоновыеф ильтры. П оаналогии сб лотингом по С аузерну(southern — ю ж ный) этотвид б лотинга б ыл назван нозерн(nothern — северный).

М етод основан на анализе РН К, при которым определяется об щ ее количество мРН Квденатурирую щ ем агарозном гелеи идентиф иц ируется по меченом у об разц у ввысуш енном геле непосредственно или на мем б ране. И спускаемый сигнал пропорц ионален сумм е иском ой РН К воб щ ей массе РН К.

контрольных об разц ов позволяет норм ализовать результаты и исклю чить влияние различных технических ф акторовна конечный результат, устраняя лю б ыеочевидныеразличия, вызванныенеравной передачей РН Ккмем б ране илинеравнойпогрузкеРН Кнагеле.

В аж ным этапом при проведении Н озерн б лотинга является выделение чистой, неповреж денной РН К. П оскольку даж е частично деградированные об разц ы РН К сниж аю т интенсивность сигнала, который смазывается или распределяется внесколько полосах или приводиткполной потери сигнала. Риб онуклеазы (РН Казы) - ф ерм енты, которые полностью и б езвозвратно инактивирую тРН К. П ри изоляц ии РН К, необ ходим о использовать РН азин в течение или после проц едуры изоляц ии, чтоб ы создавать б ез РН Казную окруж аю щ ую средудля изоляц ииРКН .

Д Н К -чип ы

О дноиз самых б ольш их ограниченийН озернанализа и- неспособ ность анализировать б ольш е чем несколько предотоб ранных геноводновременно. И спользование б иочиповснимает это ограничение и позволяет исследовать тысячи геновводном эксперим енте, давая б олеевсестороннеепредставление оэкспрессиигеноввопределенных условиях.

полинуклеотидных ячеек, а следовательно, и количество различных нуклеотидных последовательностей м ож ет превыш ать 1 м лн на 1 см 2, их длинаварьируется от9 - 10 до1000 нуклеотидов.

С ущ ествую т два основных направления создания Д Н К-чипов. И сторически первым и б ыли методы разм ещ ения на чипах предварительно хим ически синтезированных олигонуклеотидовили полученных с пом ощ ью П ЦР одноц епочечных ф рагм ентов Д Н К. С ам ым главным преим ущ еством является высокая гиб кость этих м етодов, позволяю щ ая создать чип слю б ым и треб ую щ им ися последовательностям и, но этот подход им еет недостатки, сильно ограничиваю щ ие его использование. П реж де всего, это огромные затраты труда, времениисредствнасинтез треб уем ого количестваразличных олигонуклеотидовили Д Н К. П лотность разм ещ ения Д Н К на таких чипах не м ож етпревыш ать десятковтысяч на1 см 2.

Д ругим б олее перспективным направлением является применение разраб отанных для нуж д м икроэлектроники литограф ических технологий с использованием ультраф иолетового излучения. Т акая технология позволяет синтезировать олигонуклеотиды непосредственно на поверхности чипа. П ри этом плотность их составляет несколько м иллионовна 1 см 2. Н едостатком

39

этой технологии является необ ходимость литограф ических масок, что ограничивается трудоем ким итехнологиям и.

кД Н К, приготовленныйиз двух разных об разц ов, делится надверавныечасти молекул, в которые вводятся м еченые ф луоресц ентным и группировкам и нуклеотиды (прям оеилинепрямоевклю чение). О б ычноэтозеленыйCyanine3

количество м еченых м олекул вданной ячейке чипа. Т аким об разом , м ож но получить инф ормац ию о последовательности исследуем ых Д Н К (так как каж дой определенной последовательности исследуем ой Д Н К соответствует

использование на их основе сам ых разнооб разных ранее разраб отанных методовф ерм ентативнойинеф ерм ентативнойтрансф орм ац ииД Н К, таких как лигазныеиполим еразныереакц ии.

Благодаря своим особ енностям технология Д Н К-чипов находит все б олееш ирокоеприменениевф ундам ентальных иприкладных исследованиях.

40

последовательностей. П оявилась ранее недоступная возмож ность изучать геном как ц елое. Э то новое направление получило название "геномика".

У становлениеф ункц ий геновпозволяетразраб отать м етоды этиологической диагностики патологических состояний, наприм ер злокачественного роста и способ ы управления ф ункц иейгенов, которыеответственны за их развитие, в том числе и спом ощ ью такого наиб олееперспективного метода какгенная

П роц есса анализа при пом ощ и микрочипа м ож етб ыть разделен на две главных части. С начала необ ходим о приш ить известныепоследовательности гена на стеклянные планш еты или другую твердую подлож ку. Д алее происходит скрещ иванием ф луоресц ентно пом еченного кД Н К (содерж ащ ий неизвестные последовательности, которые б удут определены) кизвестным генам , приш итым на стеклянном планш ете. П ослескрещ ивания, микрочипы идентиф иц ирую тся, используя ф луоресц ентный сканер. Анализ относительнойф луоресц ентнойинтенсивностиразличных геновоб еспечивает различиеввыраж ениигена.

вычтена из ф лю оресц енц ии каж дого пятна. Д анные тогда норм ализованы к последовательностиконтроля, вспом огательногогена, чтоб ы об ъяснять лю б ое неопределенное скрещ ивание. О сторож ность долж на б ыть предпринята при выб оре соответствую щ его вспом огательного гена; недавние изучения показали, что некоторыегены, которыеранееиспользовались какм аркерные, м огут ф актически им еть изменяю щ иеся уровни экспрессии при некоторых условиях.

Вест ерн б ло т инг

В естернб лотинг (Western blotting) - соврем енныйвысокочувствительный м етод идентиф икац ии б елков, в том числе вирусных антигенов. М етод основан на ком б инац ии гель-электроф ореза и реакц ии антиген-антитело. В ысокая степень разреш ения достигается за счет электроф оретического разделения б елков, гликоилипопротеиновимаксимальнойспец иф ичностью детектирую щ их им м унных сывороток или моноклональных антител. В