Основы современных методов изучения нуклеиновых кислот. (110

Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н Т С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю М И Н И С Т Е РС Т В О О БРАЗО В АН И Я И Н АУ КИ РО С С И ЙС КО Й

ФЕ Д Е РАЦИ И

Воронеж скийгосударственныйуниверситет

О С Н О В Ы С О В РЕ М Е Н Н Ы Х М Е Т О Д О В И ЗУ Ч Е Н И Я Н У КЛ Е И Н О В Ы Х КИ С Л О Т

Учебное п особи е

посп ец и а льност и 020201 (011600) –Би ологи я

ина п ра влени ю 020200 (510600) – Би ологи я для ст удент ов 3,4 курсов д/о

и1 курса ма ги ст ра т уры

В О РО Н Е Ж 2006

2

У тверж дено научно-м етодическим советом б иолого-почвенного ф акультета 18 января 2006 г, протокол № 1.

У чеб ное пособ ие подготовлено на каф едре ф изиологии и б иохим ии

растений б иолого-почвенного ф акультета В оронеж ского государственного ф акультета.

Рекомендовано для студентов1 курса магистратуры б иолого-почвенного ф акультетаи3 курсадневногооб учения б иолого-почвенногоф акультета.

П о спец иальности 020201 (011600) – Биология и направлению 020200 (510600) – Биология для студентов3,4 курсовд/ои1 курсамагистратуры

3

4

П ОЛИ М Е РАЗН АЯ ЦЕ П Н АЯ РЕ АК ЦИ Я

достаточно б ыстро (втечениенескольких часов) получить миллионы копий определенных нуклеотидных последовательностей. М етод б ыл предлож ен в 1983 г. К. М ю ллисом и получил ш ирокоераспространениес1985 г., когда Р. С айки ссоавторам и б ыла опуб ликована основополагаю щ ая раб ота по теории П ЦР и ееоптимизац ии. М етод П ЦР, названный «изоб ретением века» и очень скоро, в1993 г. отмеченныйН об елевскойпрем ией.

1.1 М ехан из мпо лимер аз н о й ц епн о й р еакц ии

Копирование Д Н К при П ЦР осущ ествляется спец иальным ф ерм ентом - ДНК -п оли мера зой, каки вклетках ж ивых организмов. Д Н К-полим ераза двигаясь по одиночной ц епи Д Н К (м атриц е), синтезирует ком плементарную ей последовательность Д Н К. В аж но, что Д Н К-полимераза не мож ет начать синтез ц епи Д Н К «с нуля» , ей необ ходим а короткая затравочная ц епь РН К или Д Н Кк3'-конц укоторой она мож етначать присоединять нуклеотиды. Е е преим ущ еством является терм остаб ильность, а недостатком - отсутствие3'-5' экзонуклеазной активности, что приводит к появлению ош иб ок в синтезированнойД Н К, около0.25 % вконечном продукте.

ф ункц ии (Taq Д Н К-полимераза). Э ти две группы имею т важ ные различия. Корректирую щ ие Д Н К-полимеразы б олее точны, чем полим еразы б ез 3′-5′

необ ходим о клонировать илииспользовать ванализем утац ий, использование Pfu Д Н К-полим еразы намного удоб нее. О днако для об ычной П ЦР, когда необ ходим о простое об наруж ение нуклеотидной последоваткльности или ее увеличение, наиб олеечастоиспользуется Taq полимераза.

Амплиф икац ия с использованием некорректирую щ их Д Н К-полимераз оканчивается дополнением отдельного нуклеотида к3′-конц уП ЦР-продукта, тогда как использование корректирую щ их полимераз окончивется тупозаконченным П ЦР-продуктам и. Е динственный дополнительный нуклеотид м ож етупростить проц ессклонирования.

В настоящ ееврем я для приведения П ЦР используется множ ествовидов полимераз.

Taq ДНК -Поли мера за

Taq Д Н К-полимераза выделена из б актерий Thermus aquaticus и катализирует удлинениенуклеотиднойц епивприсутствиипрайм еровв5′-3′-направлениив

5

присутствии Mg2+. Ф ерм ент не об ладает 3′-5′ экзонуклеазной активностью . Taq Д Н К-полимераза является подходящ им для б ольш инства П ЦР, которые

полим ераза не 3′-5′ экзонуклеазной активностью . Э тот ф ермент об ычно используется воб ычнойП ЦР и приП ЦР вреальном времени.

способ ен катализировать полим еризац ии Д Н К, используя вкачествеш аб лона РКН . Tth Д Н К-полимераза об ладает 5′-3′ экзонуклеазной активностью . Tth Д Н К-полим ераза об ычно используется для об ычной П ЦР и П ЦР вреальном

присутствииMg2+. Д анныйф ерментоб разуетб олее95 % продуктовступым и конц ам и. Tli Д Н К-полим ераза используется для об ычного П ЦР и П ЦР в реальном времени.

Pfu ДНК -п оли мера за

Pfu Д Н К-полимераза им еетоднуиз самых низких проц ентовош иб окиз

выступаю щ их 5'-конц овс радиоактивно меченными или простыми дН Т Ф ;

6

секвенирования; получения одноц епочечной кД Н К; получения "тупых" 3'- конц ов.

О сновной принц ип П ЦР состоит в том , что реакц ия полимеризац ии (синтеза полим ерной ц епи Д Н Киз мономерных нуклеотидных звеньев) ини-

олигонуклеотиды, им ею щ ие, какправило, разм ер от15 до30 п.н., идентичные соответствую щ им участкам Д Н К-м атриц ы.

С пец иф ичность П ЦР определяется способ ностью праймеров"узнавать" строго определенный участокД Н К и связываться сним согласно принц ипу м олекулярной ком плементарности. В реакц ии П ЦР используется пара прайм еров, которыеограничиваю там плиф иц ируем ый участоксдвух сторон, связываясь спротивополож ным иц епям иД Н К-м атриц ы.

П ри создании П ЦР-тест-систем ы одной из основных задач является правильныйподб ор прайм еров, которыедолж ны отвечать рядукритериев:

1.Д линапраймера долж наб ыть 15 - 30 нуклеотидов. У м еньш ениедлины

мож етпривестиксниж ению спец иф ичностисвязывания прайм ераиматриц ы. Д линные праймеры увеличиваю т спец иф ичность систем ы, но вних сильно возрастаетвероятность об разования вторичных структур.

2.П раймеры долж ны б ыть спец иф ичны. О соб ое вним ание уделяю т 3'- конц ам праймеров, т.к. им енно с них Taq-полим ераза начинает достраивать

ком плементарную ц епь Д Н К. Е сли их спец иф ичность недостаточна, то, вероятно, что впроб ирке с реакц ионной смесью б удут происходить синтез неспец иф ическойД Н К(коротких илидлинных ф рагм ентов). Э тозначительно услож няетоц енкурезультатовреакц ии, т.к. легко перепутать спец иф ический

приводиткзначительнойпотеречувствительности;

3.П райм еры не долж ны об разовывать дим еры и петли, т.е. не долж но об разовываться устойчивых двойных ц епей врезультате отж ига прайм еров сам их насеб я илидругсдругом ;

4.О б ласть отж ига праймеров долж на находиться вне зон м утац ий, делец ий или инсерц ий впределах видовой или иной, взятой вкачестве критерия при выб оре праймеров, спец иф ичности. П ри попадании на такую

зону, отж ига праймеров происходить не б удет, и как следствие - лож ноотриц ательныйрезультат.

5. С одерж анииГ Ц-пар впраймередолж ноб ыть около50 %. Ч ем ниж есодерж аниеГ Ц-пар впрайм ере, тем длиннееондолж енб ыть.

Эт а п ы П Ц Р

Д ля многократного увеличения количества копий исходной Д Н К нуж на ц икличность реакц ии. Как правило, каж дый из последовательно повторяю щ ихся ц икловП ЦР состоитиз трех этапов:

7

1)дена т ура ц и и , или"плавления" Д Н К, когда двух ц еп очечная Д Н Кпод действием высокойтемпературы переходитводноц епочечноесостояние;

2)связывания (от ж и га ) праймеровсм атричнойД Н К;

3)элонга ц и и , илиудлинения ц епи.

Н а стадии терм ической денатурац ии (расщ епления) двуц епочечной молекулы Д Н К при 93 – 95оС , происходит разделение комплем ентарных ц епей. Затем проб ы охлаж даю тдо 45 - 60оС , что даетвозмож ность связаться праймерам и одноц епочечным дезоксиолигонуклеотидам . П осле отж ига праймеровTaq-полим ераза начинает достраивание второй ц епи Д Н К с 3'- конц а праймера, при этом тем пература реакц ионнойсм есивновь повыш ается до 70 - 72оС , что необ ходим о для раб оты Taq-полимеразы. С м ена этапов каж дого ц икла осущ ествляется путем изм енения температуры реакц ионной смеси.

предыдущ их ц иклах. П ри этом количество основного продукта П ЦР (копии

амплиф икац иипогеометрическойпрогрессииидетлиш ь ограниченноеврем я, а затем его эф ф ективность критически падает. Э то связано стакназываемым «эф ф ектом плато» . Т ерм ин «эф ф ект плато» использую т для описания проц есса накопления продуктовП ЦР на последних ц иклах ам плиф икац ии, когдаколичествоампликоновдостигает0.3 - 1 пмолей.

В зависим остиотусловийиколичества ц икловреакц ииам плиф икац ии,

ингиб иторов, вклю чая пироф осф аты и Д Н К-дуплексы; неспец иф ические продукты или прайм ер-димеры, конкурирую щ ие за праймеры, дН Т Ф и полим еразу; конц ентрац ия спец иф ического продукта и неполная денатурац ия при высокой конц ентрац иипродуктовам плиф икац ии. Ч ем меньш еначальная конц ентрац ия Д Н К-м иш ени, тем выш е рисквыхода реакц ии на плато. Э тот моментмож етнаступить до того, какколичество спец иф ических продуктов амплиф икац ии б удет достаточно, чтоб ы их мож но б ыло проанализировать. И зб еж ать этогопозволяю тлиш ь хорош ооптимизированныетест-системы.

Ч тоб ы уменьш ить риск об разования неспец иф ических продуктов реакц ии амплиф икац ии, использую тподход, получивш ий название«горячий старт» (отангл. «hotstart » ). С уть его состоитвпредотвращ ениивозмож ности началареакц иидомоментадостиж ения впроб иркеусловий, об еспечиваю щ их спец иф ическийотж игпраймеров.

8

Д еловтом , чтовзависим остиотГ Ц-составаиразмерапраймеры имею т определенную температуру плавления (Tm), при которой об разование водородных связей нестаб ильно. Е сли тем пература систем ы превыш аетТ m, прайм ер не всостоянии удерж иваться на ц епи Д Н К и денатурирует. П ри соб лю дении оптимальных условий, т.е. температуры отж ига, б лизкой к тем пературеплавления, праймер об разуетдвухц епочечную м олекулу только

«горячегостарта» :

1. внесение вреакц ионную см есь Taq-полимеразы во врем я первого

циклапослепрогревапроб иркидотемпературы денатурац ии;

2.разделениеингредиентовреакц ионной смеси прослойкой, наприм ер, параф ина или воска на части (в ниж ней - прайм еры, в верхней - Taq-

полимераза и Д Н К-миш ени), которые смеш иваю тся при достиж ении тем пературы плавления материалапрослойки(~45 - 85ºС );

3. использованиемоноклональных антител кTaq-полим еразе. Ф ермент, связанный моноклональным и антителами, становится активным лиш ь после стадии первой денатурац ии, когда моноклональные антитела необ ратим о денатурирую тиосвоб ож даю тактивныец ентры Taq-полим еразы.

имею щ ихся ф рагментовполучить б ольш оеколичествокопии, которыемож но идентиф иц ировать м етодом электроф ореза.

1.2 Д ет екц ия пр о дукт о в амплификац ии

Для правильной оц енки результатовП ЦР важ но понимать, что данный

метод не является количественным . Т еоретически продукты ам плиф икац ии

единичных молекул Д Н К-миш ени могут б ыть об наруж ены с пом ощ ью электроф ореза уж епосле30 - 35 ц иклов. О днаконапрактикеэтовыполняется лиш ь вслучаях, когда реакц ия проходитвусловиях, б лизких кидеальным .

иных ингиб иторов, откоторых изб авиться внекоторых случаях б ываеткрайне слож но. И ногда из-за их присутствия не удается ам плиф иц ировать даж е десятки тысяч молекул Д Н К-миш ени. Т аким об разом , прям ая связь меж ду исходным количеством Д Н К-м иш ени и конечным количеством продуктов ам плиф икац иичастоотсутствует.

Мет одгори зонт а льногоэлект рофореза

Д ля визуализац ии результатовам плиф икац ии использую т различные м етоды. Н аиб олее распространенным на сегодняш ний день является метод электроф ореза, основанный на разделении молекул Д Н К по разм еру. Д ля этого готовятпластину агарозного геля, представляю щ его соб ой застывш ую послерасплавления вэлектроф орезном б уф ереагарозувконц ентрац ии0.8 – 2 % с доб авлением спец иального красителя Д Н К, - наприм ер, б ромистого