Выделение клинических изолятов бацилл и методы определения их безвредности и пробиотических свойств

УДК 576.8:576.851.5:725.59619

Авторы: И.Г. Позднякова, Л.С. Назарова

В настоящих рекомендациях описаны методы выделения из внешней среды бацилл, определение их безвредности и возможности использования в качестве пробиотиков.

2

распространение резистентных к дезинфицирующим средствам и антибиотикам штаммов условно-патогенных микроорганизмов в лечебных учреждениях для людей и животных, на фермах и в индивидуальных хозяйствах (1,2,3,4). Для решения проблем дезинфекции в помещениях,

где содержатся животные и лечения ран, дисбактериозов предлагается управление средой на микробиологическом уровне за счѐт использования микроорганизмов со свойствами пробиотиков (2). Последние представляют собой безопасные для макроорганизма бактерии, обладающие антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам. Свойства пробиотиков отмечены у представителей различных семейств и родов бактерий, в том числе у рода Bacillus.

Бактерии рода Bacillus- одни из наиболее разнообразных и широко распространѐнных групп микроорганизмов в окружающей среде. На основе бацилл создан «Концентрат ORGANICS Zoo Professional» (производитель Германия), содержащий споры подобных бактерий (6). Вместе с тем штаммы B. subtilis и B. cereus со свойствами пробиотиков получают из различных источников, но не из конкретного стационара или фермы,

поэтому нельзя быть уверенным в их эффективности в качестве антагонистов условно-патогенных бактерий, циркулирующих в конкретном помещении.

3

1. Оборудование, материалы, реактивы, объекты

1.1. Оборудование и материалы

1. Микроскоп;

2.Автоклав;

3.Термостат;

4.Сушильный шкаф;

5.Пробойник;

6.Бактериологическая петля;

7.Стеклянный шпатель;

8.Чашки Петри;

9.Пробирки;

10.Предметные стѐкла;

11.Ватные тампоны стерильные;

12. Стандарт мутности бактериологический (0,5 по Мак-Фарланду); 13. Физиологический раствор 0,85% Na Cl;

14. 3% раствор перекиси водорода;

15. Реактив Грисса; 16. Краски: генцианвиолет, раствор Люголя, йодированный спирт,

фуксин Пфейффера.

1.2. Питательные среды Мясо-пептонный агар (МПА), 5% кровяной агар (КА), желточно-

солевой агар (ЖСА), мясо-пептонный бульон (МПБ), питательный желатин, среды Гисса, дифференциально-диагностическая среда для B. cereus. (агар желточный с полимиксином и феноловым красным).

1.3. Штаммы условно-патогенных микроорганизмов Музейные штаммы бактерий: разные виды стафилоккоков,

стрептококков, протея, синегнойной палочки, кишечной палочки.

4

Клинические изоляты штаммов бактерий, циркулирующих в

конкретном лечебном учреждении для людей и животных, а также в помещениях, где содержатся животные: золотистый стафилоккок,

кишечная палочка, моракселлы, ацинетобактер и другие.

1.4. Объект Беспородные белые мыши массой 18-20 г обоего пола.

ХОД ИССЛЕДОВАНИЯ

2. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха и

поверхностей

Бациллы выделяют из воздуха и поверхностей при проведении санитарно-микробиологического исследования лечебного учреждения или других помещений, где содержатся животные.

Для исследования микробного обсеменения воздуха в помещении чашки Петри с МПА и ЖСА оставляют открытыми на 10 мин, с КАна 40

мин. Затем крышки закрывают, чашки Петри ставят в термостат при температуре 37 0С. Через сутки оценивают результаты: количество выросших колоний и их характеристики, делают мазки и окрашивают по Граму.

Для исследования микрофлоры поверхностей стерильным ватным тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором, с площади

1м2 или со всей поверхности небольших объектов берут смывы и помещают в пробирку с 1 мл стерильного физиологического раствора,

встряхивают в течение 5 минут, после этого осуществляют посев по 0,1мл на питательные среды: МПА, КА и ЖСА. Посевы инкубируют при 37 0С в течение суток. После этого оценивают результаты, как указано выше.

5

2.1. Определение принадлежности бактерий к роду Bacillus и

конкретному виду по морфологическим, культуральным и биохимическим признакам

У выросших колоний на питательных средах исследуют размеры,

форму, характер краѐв, поверхности и определяют колонии, типичные для роста бацилл. Колонии бацилл разных штаммов имеют различие в структуре. В основном они крупные белого цвета, имеют складчатую поверхность, неровные края.

Для дальнейших исследований колонии негемолитических бацилл отсевают в пробирки на скошенный МПА для получения суточной культуры, у которой затем изучают биохимические признаки (наличие каталазы, лецитиназы, сахаролитическую активность, восстановление нитратов).

По морфологическим признакам бациллы представляют собой грамположительные спорообразующие палочки. Располагаются в мазке в виде одиночных клеток, парами или цепочками. Споры не превышают диаметра клетки. Являются аэробами или факультативными анаэробами.

Бациллы подвижные, на жидкой питательной среде образуют плѐнку

(аэробы) или плѐнку и диффузное помутнение (факультативные анаэробы).

Они неприхотливые и хорошо растут на простых питательных средах:

МПА, МПБ, не растут на ЖСА. Патогенные штаммы на КА могут давать зоны гемолиза.

Вид бацилл определяют с использованием дифференциально-

диагностической среды: агара желточного с полимиксином и феноловым красным, на которой B. cereus растут в виде окрашенных колоний красного цвета, а также по ряду биохимических тестов: наличию каталазы,

протеолитической активности, расщеплению глюкозы, мальтозы,

образованию лецитиназы, восстановлению нитратов.

Тест на каталазу: производят с суточной культурой, помещая еѐ на предметное стекло в каплю 3% перекиси водорода стеклянной палочкой.

6

При наличии у микроорганизма каталазы в капле раствора появляются пузырьки кислорода, реакция считается положительной.

Тест на сахаролитическую активность: проводят с использованием короткого ряда сред Гисса, включающего маннит,

мальтозу, глюкозу. Пробирки со средами засевают петлѐй суточной культурой уколом до дна пробирки. Проводят инкубирование в термостате при 37 0С в течение суток, затем по изменению цвета оценивают результаты.

Тест на восстановление нитратов: основан на выявлении нитритов в испытуемой культуре при помощи реактива Грисса. Из суточной бульонной культуры берут 1мл в пробирку, затем добавляют 1-2 капли реактива Грисса. Появление красного окрашивания в течение нескольких минут свидетельствует о присутствии нитритов и положительном результате теста.

Тест на лецитиназу: 16-18 часовую культуру высевают на желточную среду в чашки Петри в виде зигзагообразного штриха. Посев инкубируют от 24 до 48 ч, затем учитывают результат. Положительный результат характеризуется образованием вокруг лецитиназообразующих колоний непрозрачной опалесцирующей зоны.

По результатам тестов с помощью определителя бактерий Берджи устанавливают вид бацилл.

2.2. Определение патогенности бацилл in vitro

Патогенность бацилл определяют по разжижению желатины

(протеолитическая активность). Тест на определение этой активности основан на изучении необратимого разжижения желатина под воздействием микробных протеаз. Для этого столбик питательного желатина засевают уколом до дна пробирки испытуемой суточной культурой. Посев инкубируют в термостате при температуре 37 0С.

Параллельно в термостат ставят контрольные пробирки с незасеянными

7

средами. Учѐт результатов реакции проводят через 24 часа. В случае положительного результата засеянная среда при охлаждении еѐ до комнатной температуры остаѐтся жидкой, что свидетельствует о патогенности бацилл. Если среда остаѐтся студнеобразной, бациллы непатогенные, их используют для дальнейших исследований.

3. Определение бактерицидной активности бацилл

Из суточных культур штаммов бацилл по стандарту мутности 0,5

по Мак-Фарланду (108м.к./мл) готовят взвесь в стерильном физиологическом растворе 0.85% Na Cl. Затем по 1мл вносят инокулят в чашку Петри с МПА. Стеклянным шпателем распределяют его по всей поверхности и помещают в термостате при 370С. Чашки Петри с бациллами выращивают в течение 3-х суток.

Посев тестируемых культур штаммов условно-патогенных микроорганизмов на чашки Петри с питательным агаром проводят в день постановки теста, используя аналогичный по стандарту мутности инокулят и питательный агар.

По прошествии 3-х суток на чашках Петри с выращенными бациллами пробойником отбирают агаровый блок и помещают в чашку Петри с условно-патогенными микроорганизмами, на газоне которых предварительно тем же пробойником делают «колодцы». Перед каждым вырезанием блоков пробойник помещают в спирт и обжигают над пламенем горелки. Тестируемые культуры с агаровыми блоками помещают в термостат при 37 0С на одни сутки. Затем учитывают результат.

Бактерицидное действие бацилл оценивают по отсутствию роста исследуемых микроорганизмов вокруг агаровых блоков по принципу диско-диффузионного метода с дисками, пропитанными антибиотиками.

По диаметру этих зон определяют степень бактерицидной активности.

Бациллы могут изменять другие свойства условно-патогенных штаммов бактерий: подавлять роение у протеев и выделение пигмента у синегнойной

8

палочки. Прямое антагонистическое действие на условно-патогенные бактерии может проявляться по способности бацилл выселяться за пределы агарового блока и подавлять рост других культур.

4. Определение патогенности бацилл для животных

Суточную культуру бацилл, не разжижающих желатин и обладающих антагонистическими свойствами по отношению к условно-

патогенным бактериям, петлѐй вносят в пробирку с 10мл стерильного физиологического раствора и стандартизируют по оптическому стандарту мутности, так чтобы в 1мл содержалось 108м.к.

Полученную взвесь бацилл вводят одной группе белых мышей (5

особей) в количестве 0,5 мл внутрибрюшинно. Другой группе из 5-ти животных в количестве 1капли вводят через рот пипеткой. Контрольным группам в аналогичных условиях вводят раствор 0,85% Na Cl.

За животными наблюдают в течение 14 суток. При отсутствии патогенности у штаммов бацилл, мыши должны выжить и быть активными,

хорошо поглощать корм. Для более строгого контроля безвредности и пробиотической активности бацилл для макроорганизма проводят его изучение на фоне иммунодепрессанта.

5. Определение безвредности бацилл на фоне иммунодепрессанта

(циклоспорина) и их пробиотической активности в условиях

макроорганизма

Иммунодепрессантом служит циклоспорин, терапевтическая пероральная суточная доза которого соответствует рекомендованной для человека с пересчѐтом на массу тела животного.

В качестве пробиотических штаммов используют изученные по всем остальным тестам штаммы Bacillus cereus.

Первоначально всем мышам проводят обработку циклоспорином с введением его через рот в течение 5 суток. Другой группе мышей в

9

аналогичных условиях вводят воду (контроль). Содержание животных одинаковое. Через 5 суток умерщвляют по 2 мыши, обработанные циклоспорином и контрольные, изучают у них макроскопические и микроскопические изменения во внутренних органах (печени, почках,

селезѐнки, лѐгких, желудочно-кишечном тракте).

После окончания обработки циклоспорином и водой делят животных на 5 подгрупп по 5 особей в каждой.

Для проведения основного опыта отдельно на МПА культивируют каждый из штаммов B. cereus в течение 5 суток. Непосредственно в день эксперимента микроорганизмы суспендируют в стерильном физиологическом растворе в дозе 108м.к./мл каждый и смешивают.

Подобное смешивание рекомендуют делать, если предполагают использовать не один, а несколько штаммов бацилл с различными пробиотическими свойствами для дополнения действия одного штамма другим. Животным, в зависимости от задачи опыта, вводят разные дозы этой смеси.

Первым подгруппам мышей через рот однократно вводят по 0,1 мл смеси бацилл, вторым внутрибрюшинно по 0,5мл. У третьих, четвѐртых и пятых подгрупп предварительно под эфирным наркозом иссекают в межлопаточной области кожный лоскут размером 1x1см. После этого на поверхность раны наносят физиологический раствор со смесью суточных культур музейных штаммов условно-патогенных микроорганизмов:

Staphylococcus aureus, Moraxella spp, Escherichia coli в дозе 105 м.к. каждый можно использовать другие сочетания микроорганизмов.

Через сутки после инфицирования раны начинают обрабатывать смесью B. cereus 2 раза в день в дозе 103 м.к. (3-м подгруппам мышей), 105

м.к. (4-м подгруппам). 5-ым подгруппам животных наносят на раны стерильный физиологический раствор хлористого натрия (контроль).

Животных всех подгрупп содержат в равных условиях но в изолированных клетках. Первые две подгруппы умерщвляют через 14

10