контрольных материалов и методов (Institute for Reference Materials and Methods, Бельгия). Тест-система «АмплиКвант ГМ соя» комплектуется калибровочными стандартами, представляющими собой экстракты ДНК, полученные из вышеупомянутых сертифицированных стандартов ГМИ.

Все анализируемые образцы, включая калибровочные стандарты, рекомендуется тестировать в двух повторах.

Тест-система «АмплиКвант ГМ соя» состоит из двух комплектов реагентов:

-комплект № 1 – «ДНК-сорб-С» для выделения ДНК из пищевой продукции и кормов для животных;

-комплект № 2 – «ПЦР-TM» для проведения реакции амплификации (с детекцией в режиме реального времени).

Перед использованием реагентов необходимо убедиться в соблюдении условий их хранения и сроков годности.

Материалы для исследования

-соевая мука-сырьё, концентрат соевого белка;

-мясные продукты, приготовленные с добавлением сои (фарш, вареные колбасы, сосиски, сардельки и т.д.);

-продукты, изготовленные из сои (колбаса соевая, паштет соевый, азу соевое, котлеты соевые и др., творог соевый, молоко соевое, соевые сухие напитки, сыр соевый, шоколад, детское питание – заменители женского молока на основе соевого белка);

-продукты, содержащие кукурузу (заменители сухого молока и сливок, крахмал кукурузный и т.д.).

Отбор образцов

От партии сырья или сыпучих продуктов отбирают общую пробу следующим образом:

-от исследуемой партии сырья или сыпучих продуктов отбирают не менее 10 образцов проб (по 5 – 10 г) в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет размером 20х30 см с использованием одноразовых хирургических перчаток и перемешивают, формируя общую пробу (50 –

100 г);

-из общей пробы отбирают среднюю пробу в 10 – 20 г, помещают в полиэтиленовый пакет с застёжкой-молнией размером не более 10х15 см, который, в свою очередь, помещают в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет размером 20х30 см, опечатывают и отправляют на анализ.

От партии продуктов плотной консистенции отбирают общую пробу весом 10 – 50 г в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет с

120

застёжкой-молнией размером не более 10x15 см, используя одноразовые перчатки и фламбированные (выдержанные в 96% этаноле и обожжённые в пламени газовой горелки) инструменты, опечатывают и отправляют на анализ.

Пробы жидких продуктов отбирают в чистые ёмкости из стекла или пластика с герметично закрывающимися крышками объёмом не более 50 мл, опечатывают и отправляют на анализ.

Пробоподготовка

Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые пробирки, ступки и пестики, предварительно обработанные хромовой смесью, и фламбированные пинцеты, скальпели, ножницы.

Пробы сухих гранулированных и сыпучих продуктов отбирают в ступку по 3 – 5 г и растирают пестиком до гомогенного состояния. Для анализа необходимо 10 – 30 мг образца.

Пробы плотных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 3 – 5 г помещают в ступку, измельчают ножницами, затем растирают пестиком до гомогенного состояния. Для анализа необходимо 10 – 30 мг образца.

Пробы продуктов консистенции крахмала весом 10 – 30 мг помещают в одноразовые пластиковые пробирки и добавляют 0,1 мл физиологического раствора. Для анализа необходимо 50 мкл образца.

Пробы жидкой консистенции отбирают автоматическими пипетками с одноразовыми наконечниками в одноразовые пробирки из полипропилена. Для анализа необходимо 50 мкл образца.

Из полученных гомогенатов и суспензий проводят выделение ДНК.

Хранение и транспортирование предварительно обработанных проб

Образцы сырья и продуктов рекомендуется хранить в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа) согласно условиям, указанным производителем продукта питания. Образцы скоропортящихся продуктов рекомендуется хранить в замороженном состоянии (при температуре минус 20 C) в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа).

Транспортирование образцов осуществляют при температуре, рекомендованной для хранения сырья или пищевого продукта. Длительность транспортирования не должна превышать сроков годности продукта.

121

Меры предосторожности

1.Каждый из двух этапов анализа проводится в отдельном помещении (зоне).

2.Работать следует только в одноразовых перчатках, одноразовые наконечники для автоматических пипеток использовать и менять при каждой операции.

3.Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перенос из одного помещения в другое.

4.Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо облучать ультрафиолетовым светом в течение 10 минут.

5.Запрещается открывать пробирки, содержащие фрагменты амплификации.

Материалы и оборудование для ПЦР-анализа

ЗОНА 1 – выделение ДНК из исследуемого материала. Требуются:

1.Настольный бокс с бактерицидной лампой (например, «Циклотемп» фирмы СП «РТС» (Россия)) или стерильный ламинарный шкаф (БОВ-001- АМС (г. Миасс, Россия)).

2.Термостат для пробирок типа «Эппендорф» на 25-100 °С (например, «ТЕРМО-24» фирмы «Биоком» (Россия)).

3.Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16000 g (например, фирмы «Elmi» (Латвия), фирмы «Hettish» (Германия)).

4.Центрифуга/вортекс (например «Micro-Spin» (Германия), «ТЭТА-2» фирмы «Биоком» (Россия)).

5.Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, ОМ-1 (г. Ульяновск, Россия)).

6.Отдельный набор автоматических пипеток переменного объёма (например, фирмы «Ленпипет» (Россия)).

7.Отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки.

8.Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, фирмы «Axygen» (США)).

9.Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, фирмы «Хеликон», Россия) и наконечников (например, фирмы «Ленпипет» (Россия)).

10.Одноразовые наконечники для пипеток переменного объёма до 200 мкл и до 1000 мкл (например, фирмы «Ленпипет» (Россия)).

122

11.Одноразовые наконечники для пипеток переменного объёма с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, фирмы «Axygen» (США)).

12.Холодильник с отделениями на 2 – 8 °С и от минус18 до минус 20 °С.

13.Ёмкость с дезинфицирующим раствором.

14.Комплект средств для обработки рабочего места.

15.Реактивы – Комплект «ДНК-сорб-С»:

ЗОНА 2 – амплификация ДНК. Требуются:

1.Амплификатор «RotorGene 2000/3000» фирмы «Corbett Research» (Австралия), или «ABI-PRISM-7000, 7700» фирмы «Applied Biosistems»

(США), или «iCycler» фирмы «Bio-Rad» (США).

2.ПЦР-бокс или отдельный стол, освещаемый УФ-лампой (например, «Циклотемп» фирмы СП «РТС» (Россия)).

3.Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема (например, фирмы «Ленпипет» (Россия)).

4.Штативы для микропробирок на 0,2 мл (например, фирмы «Хеликон» (Россия)).

5.Одноразовые наконечники для микропипеток в штативах (например, фирмы «Хеликон» (Россия)).

6.Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мкл (например, фирмы «Axygen» (США)).

7.Холодильникна2–8°С;морозильникнаминус20°СдляхранениявыделеннойДНК.

8.Отдельный халат и одноразовые перчатки.

9.Ёмкость для сброса наконечников.

10.Комплект средств для обработки рабочего места.

11.Реактивы – комплект для проведения реакции амплификации с детекцией в режиме реального времени:

123

Обратите внимание на то, что «ПЦР-смесь-1-ГМсоя-TM»-60-R, «ПЦР- смесь-1-ГМсоя-TM», «TaqF-полимераза» хранится при температуре минус 20оС. Кроме того, реагенты, содержащие флуоресцентные метки («ПЦР- смесь-1-TM»), следует беречь от света.

Проведение анализа

ЭТАП 1. Выделение ДНК из образцов материала, подготовленных к исследованию (проводится в ЗОНЕ 1 – помещении для обработки исследуемого материала).

1.Буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 (если они хранились при 2 – 8 оС) прогреть при 64оС до полного растворения кристаллов.

2.Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок, включая отрицательный контроль выделения ДНК. В пробирки, предназначенные для исследуемых проб, внести образцы исследуемых проб (см. «Предобработка проб образцов»). В пробирку отрицательного контроля выделения ДНК (ОК) внести 100 мкл отрицательного контрольного образца (ОКО).

3.Отдельными наконечниками с аэрозольным барьером внести в каждую пробирку по 400 мкл буфера для лизирующего реагента и по 17

мкл лизирующего реагента. Тщательно перемешать содержимое пробирок.

4.Инкубировать пробирки при 64оС в течение 1 часа, периодически встряхивая на вортексе (5 раз через каждые 10 – 12 мин.).

5.Осадить нерастворённые частицы образцов центрифугированием

при (12-14) 103 об/мин. в течение 5 минут.

6. Надосадочную жидкость в объёме 200 – 350 мкл очень аккуратно (так, чтобы не попали взвешенные частицы и капли жира) отобрать отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами и перенести в новые пробирки.

124

7.Пробы центрифугировать в течение 5 сек. при 5 103 об/мин. на микроцентрифуге для сброса капель с крышки пробирок.

8.Тщательно ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, оставить в штативе на 10 – 15 мин., перемешивая через каждые 2 минуты.

9.Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 103 об/мин. в течение 1 минуты. Удалить супернатант (надосадочную жидкость), используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

10.Добавить в пробы по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Осадить сорбент

центрифугированием при 5 103 об/мин. на микроцентрифуге в течение 1 минуты. Удалить супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

11. Добавить в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, процентрифугировать 1 мин. при (10 – 12) 103 об/мин. на микроцентрифуге. Отобрать супернатант, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.

12. Повторить процедуру отмывки, следуя пункту 11, отобрать супернатант полностью.

13. Поместить пробирки в термостат 64ºС на 5 – 10 мин. для подсушивания сорбента. При этом крышки пробирок должны быть открыты.

14.В пробирки добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК.

Перемешать на вортексе. Поместить в термостат 64ºС на 5 – 8 мин., периодически (1 раз в минуту) встряхивая на вортексе.

15.Процентрифугировать пробирки при (12 – 14) 103 об/мин. в течение 1 мин. на микроцентрифуге. Супернатант содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Очищенную ДНК допускается хранить в течение 1 недели при

температуре от 2 до 8 С и в течение 1 года – при температуре минус 20 С.

ЭТАП 2. Реакции амплификации

1.Разморозить необходимое количество пробирок с ПЦР-смесь-1- ГМсоя-TM (1 пробирка рассчитана на постановку 10 реакций). Перемешать на встряхивателе и сбросить капли с помощью кратковременного центрифугирования.

2.Для проведения N реакций смешать в отдельной пробирке 8*(N+1)

мкл ПЦР-смеси-1-TM, 7*(N+1) мкл 2,5-х ПЦР-буфера и 0,5*(N+1) мкл

TaqF-полимеразы. Например, для проведения пяти реакций следует взять

8*(5+1)=48 мкл ПЦР-смеси-1-TM, 7*(5+1)=42 мкл 2,5-х ПЦР-буфера и 0,5*(5+1)=3 мкл TaqF-полимеразы.

125

3. Перемешать смесь на встряхивателе, осадить кратковременным центрифугированием и внести по 15 мкл в микропробирки на 0,2 мл с

оптически прозрачными крышками.

4.Используя наконечник с аэрозольным барьером, в подготовленные пробирки добавить по 10 мкл ДНК исследуемых образцов. При этом следует избегать попадания сорбента в реакционную смесь. Каждый исследуемый образец тестируется в двух повторах.

5.При каждой постановке анализа необходимо поставить 6 точек калибровочных стандартов. Для этого для каждого калибровочного стандарта готовят 2 пробирки, в которые вносят по 10 мкл калибровочных стандартов – Кст 0,1%, Кст 1% и Кст 5 %.

6.Кроме того, необходимо поставить контрольные образцы – отрицательный контроль ПЦР (в одну пробирку вносят 10 мкл ТЕ-буфера) и положительный контроль ПЦР (в одну пробирку вносят 10 мкл ПКО ГМсоя

1%).

7.Поместить пробирки в карусель амплификатора (ячейки карусели пронумерованы, эти номера используются в дальнейшем для программирования положения проб в амплификаторе).

8.Запрограммировать амплификатор.

Программирование амплификатора Rotor-Gene 6:

1.Включить прибор.

2.Для работы с прибором следует установить версию программы

Rotor-Gene 6.

3.Нажать кнопку «New» в основном меню программы.

4.Выбрать объём реакционной смеси и тип карусели:

Reaction volume – 25 мкл;

Carousel-36-Well.

5.Нажать кнопку «Next».

6.В верхней части окна нажать кнопку «Edit profile».

7.Задать следующие параметры эксперимента:

-Hold: 95оС – 15 мин.;

-Cycling:95оС – 10 сек., 59оС – 60 сек.;

-Cycle repeats – 40 times.

Флюоресценцию измеряют при 59 С на каналах Fam и Joe. После этого нажать дважды кнопку OK.

8.В нижней части окна нажать кнопку «Calibrate», выбрать функцию:

«Perform Calibration Before 1st Acquisition». Для красителя JOE установить параметры Min reading – 1,5FL и Max reading – 8Fl. Для этого выделить мышкой строку JOE в меню и нажать кнопку Edit на правой панели окна. Нажать кнопку OK. Для красителя FAM установить параметры Min reading

–5FL и Max reading – 10Fl. Окно закрыть, нажав кнопку «Close».

7.Нажать кнопку «Next», запустить амплификацию кнопкой «Start run».

126

8. Дать название эксперимента и сохранить его на любом диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента).

В процессе работы амплификатора или по окончании его работы необходимо запрограммировать положение пробирок в карусели. Для этого надо использовать кнопку «Edit samples» (в нижней правой части основного окна). Все исследуемые образцы, калибровочные стандарты и контроли обозначить как Sample.

Программирование амплификатора «ABI-PRISM 7000 SDS»:

1.Включить прибор.

2.Запустить программное обеспечение прибора «ABI-PRISM 7000 SDS».

3.Создать документ SDS Template в котором программируются используемые зонды и программа амплификации. Для этого в окне File ниспадающего меню выбрать опцию New. Откроется окно New Document, в котором следует определить параметры нового документа: В окне Assay

выбрать опцию Absolute Quantitation, в окне Template выбрать опцию Blank Document. Нажать кнопку ОК. Если прибор ABI PRISM 7000 находится в соединении с компьютером, произойдет его инициализация: в этом случае

внижней части панели дисплея справа должна появиться надпись Connected. Откроется окно нового документа Plate с активным полем Setup Plate.

Открыть окно «Detector Manager». В нижнем левом углу окна в ниспадающем меню File выбрать New, при этом откроется окно New detector, характеризующее используемый зонд.

Запрограммировать следующие характеристики зонда для детекции промотора 35S: В строке Name указать название зонда – 35S. В строке Description указать назначение зонда – GMO. В строке Reporter Dye выбрать название флуоресцентной метки-репортёра – FAM. В строке Quencher Dye указать – None. Выбрать цвет (например, красный), нажав значок Color. Нажать кнопку Create Another. Снова откроется окно New detector, характеризующее используемый зонд.

Запрограммировать следующие характеристики зонда для ДНК сои: в строке Name указать название зонда – ВК. В строке Description указать назначение зонда – ВК. В строке Reporter Dye выбрать название флуоресцентной метки-репортёра – JOE. В строке Quencher Dye указать– None. Выбрать цвет (например, синий), нажав значок Color.

Нажать ОК. В окне Detector manager появится информация о выбранных зондах. Закрыть окно, нажав на крестик в правом верхнем углу. Перейти в окно Instrument, щёлкнув по нему мышкой. Активировать лист Thermal profile, в

котором программируется следующая программа амплификации:

Стадия 1 (Stage 1) – один шаг (Reps 1) хранение при 95°C в течение 15 мин. (15:00). Стадия 2 (Stage 2) – цикл, повторяющийся 40 раз (Reps 40), и

состоящий из двух шагов – денатурация при 95°C в течение 10 секунд (0:10), отжига/элонгации при 59°C в течение 1 мин. (1:00).

127

Далее следует указать объём реакционной смеси – 25 мкл в окне Sample volume. Выбрать режим амплификации 9600, поставив отметку в

прямоугольнике 9600 Emulation.

Сохранить созданный документ под именем GMO Template. Для этого в ниспадающем меню File выбрать save as…, в строке File type выбрать SDS Templates (*.sdt) и нажать кнопку Save. Запомнить местоположение сохраненного документа.

Закрыть документ, нажав на крестик в правом верхнем углу.

4.Создать новый документ Plate, в котором будут сохранены результаты тестирования. Для этого в окне File ниспадающего меню выбрать опцию New. Откроется окно New Document, в котором следует определить параметры нового документа: В окне Assay выбрать опцию Absolute Quantitation, экспортировать файл GMO Template нажав кнопку Browse. Нажать кнопку ОК.

Если прибор ABI PRISM 7000 находится в соединении с компьютером, произойдет его инициализация. В нижней части панели дисплея справа должна появиться надпись Connected. Откроется окно нового документа Plate, имеющего необходимые параметры амплификации.

Выделить с помощью мышки ячейки, в которых планируется постановка амплификации. Открыть окно Well inspector. Нажать кнопку

Add Detector и выбрать зонды – 35S и ВК из окна Detector manager. Для этого выделить строки с помощью мышки и нажать клавиши Add to Plate Document и Done. В столбце Use окна Well inspector отметить галочками зонды – 35S и ВК. В правом нижнем углу в строке Passive Reference выбрать ROX.

Далее следует подписать названия образцов. Для этого с помощью мыши выделить каждую реакционную лунку (можно сразу несколько) и напечатать название образца (для выделенных лунок) в поле Sample Name.

Повторить операции для всех образцов (Кst0,1 %, Кst1 %, Кst5 %, K+, K- и тестируемых образцов). Между цифрой и знаком % оставлять пробел, например, Кst1 %.

Закрыть окно Well inspector, нажав на крестик в правом верхнем углу окна. Перейти в окно – Instrument, щёлкнув по нему мышкой. Проверить правильность параметров амплификации.

5.Сохранить созданный документ. Для этого в ниспадающем меню File выбрать Save As… Тип документа (File type) должен быть SDS Documents (*.sds). Для этого в строке Save in выбрать папку, в которой будут храниться файлы с результатами анализа. В строке File name напечатать имя файла, желательно содержащее дату анализа. Нажать кнопку Save.

После выполнения последней операции установка программного обеспечения завершена и прибор готов к выполнению анализа, для чего планшет с готовыми к амплификации пробами устанавливают в прибор и нажиают кнопку Start в окне Instrument.

128

Программирование амплификатора «iCycler»

1.Включить прибор и блок питания оптической части прибора. Проводить измерения не менее, чем через 30 мин. после включения оптической части прибора.

2.Открыть программу iCycler.

3.Перейти в окно Workshop и, выбрав опцию Edit Protocol, создать программу амплификации, для чего в нижнем окне задать параметры амплификации (количество циклов, время и температуру циклирования), а в окне справа указать шаг считывания флуоресцентного сигнала: Cycle 2 – Step 2.

Установить программу «GMO» для амплификатора «iQ iCycler»:

– 95º С – 15 мин.;

– 42 цикла: 95ºС – 15 сек., 59ºС – 60 сек.;

– детекция флуоресценции на 2 шаге (59ºС) циклирования.

Сохранить протокол, задав имя файла в окне Protocol Filename (GMO.tmo) и нажав кнопку Save this protocol (в верхней части экрана).

4.Выбрав опцию Edit Plate Setup, задать Plate Setup. Для этого в опции Samples: Whole Plate Loading задать схему расположения образцов в реакционном модуле и указать имя каждой пробы в окне Sample Identifier.

Вопции Select and load Fluorophores задать измерение флуоресцентного сигнала во всех пробирках по каналам FAM и JOE. Сохранить Plate Setup, задав имя файла в окне Plate Setup Filename (с расширением .pts) и нажав кнопку Save this plate setup (в верхней части экрана). Можно редактировать уже использованный ранее Plate Setup, для этого в окне Library открыть View Plate Setup, выбрать нужный Plate Setup (файл с расширением .pts) и нажать кнопку Edit справа. Отредактированный файл нужно также сохранить перед использованием.

5.Поместить предварительно подготовленные пробирки в модуль в соответствии с заданной схемой.

6.Перейти в окно Library. Выбрать программу GMO.tmo в закладке

View Protocol и нажать кнопку Run with selected plate setup.

7.В открывшемся окне проверить правильность указания программы

(Protocol) и Plate setup.

8.В том же окне задать использование экспериментального планшета для измерения факторов лунок. Для этого в меню Select Well Factor Source

выбрать вариант Experimental Plate.

9.Задать объём реакционной смеси в окне Sample Volume (25 mkl).

10.Нажать кнопку Begin Run.

11.После окончания программы приступить к анализу результатов.

Анализ результатов

129

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ НА АМПЛИФИКАТОРЕ

ROTOR-GENE 6

Для анализа результатов амплификации промотора 35S:

1.Нажать в меню кнопку «Analysis», выбрать режим анализа

«Quantitation», нажать кнопку «Cycling A. Fam», «Show».

2.Отменить автоматический выбор Auto-Find Threshold.

3.В меню основного окна (Quantitation analysis) нажать кнопку «Dynamic tube». Нажать кнопку Ignore first, установить значение 8 cycles и нажать ОК.

4.Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale видна кнопка Log scale).

5.В меню «CT Calculation» (в правой части окна) выставить Threshold = 0,1.

6.В меню «Eliminate cycles before» (в правой части окна) выставить 10.

7.В таблице результатов (окно «Quant. Results») появятся значения Ct. Для анализа результатов амплификации ЭК соя (эндогенного контроля):

1.Нажать в меню кнопку «Analysis», выбрать режим анализа

«Quantitation», нажать кнопку «Cycling A. Joe», «Show».

2.Отменить автоматический выбор Threshold.

3.В меню основного окна (Quantitation analysis) должна быть нажата кнопка «Dynamic tube».

4.Выбрать линейную шкалу графического изображения результатов, нажав кнопку Linear scale в нижней части окна справа (если эта шкала активна по умолчанию, вместо кнопки Linear scale будет видна кнопка Log scale).

5.В меню «CT Calculation» (в правой части окна) выставить Threshold = 0,2.

6.В меню «Eliminate cycles before» (в правой части окна) выставить 10.

7.В таблице результатов (окно «Quant. Results») появятся значения Ct.

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ НА АМПЛИФИКАТОРЕ

ABI-PRISM 7000

Анализ результатов проводится после завершения реакции. При этом в нижнем левом углу окна Instrument должна появиться надпись Ready. Перейти в окно Results и открыть лист Amplification plot.

Для анализа результатов амплификации промотора 35S:

1.В графе Detector выбрать 35S.

2.Выделить с помощью мышки лунки, в которых находятся анализируемые образцы.

3.Выбрать режим ручной установки пороговой линии Manual Ct и автоматической установки Baseline Auto Baseline и нажать кнопку Analize.

4.Установить положение линии Threshold (используя курсор мыши).

5.Нажать на кнопку Analyze.

130

Для анализа результатов амплификации ВК соя (эндогенного внутреннего контроля):

Вграфе Detector выбрать ВК.

1.Выделить с помощью мышки лунки, в которых находятся анализируемые образцы.

2.Выбрать режим ручной установки пороговой линии - Manual Ct и автоматической установки Baseline - Auto Baseline и нажать кнопку Analize.

3.Установить положение линии Threshold (используя курсор мыши).

4.Нажать на кнопку Analyze.

5.Результаты анализа будут представлены в окне Report.

После этого следует экспортировать результаты анализа в текстовый файл. Для этого в ниспадающем меню File выбрать Export и Results...

Сохранить его в формате Results Export File (.csv), указав дату анализа.

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ, ПОЛУЧЕННЫХ НА АМПЛИФИКАТОРЕ iCYCLER

Анализ результатов амплификации промотора 35S:

1.В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала FAM-490.

2.В меню Treshold Cycle Calculation выбрать автоматический расчёт пороговой и базовой линий. Для этого в подменю Baseline Cycles и Threshold Position выбрать Auto Calculated. При этом должен быть выбран режим анализа данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию).

3.В таблице результатов появятся значения Ct.

Анализ результатов амплификации ЭК соя (эндогенного контроля):

4.В опции PCR Quantification в меню Select a Reporter выбрать значок канала JOE-530.

5.В меню Treshold Cycle Calculation выбрать автоматический расчет пороговой и базовой линий. Для этого в подменю Baseline Cycles и Threshold Position выбрать Auto Calculated. При этом должен быть выбран режим анализ данных PCR Base Line Subtracted Curve Fit (выбирается по умолчанию).

6.В таблице результатов появятся значения Ct.

7.При повторном анализе полученных ранее данных выбрать нужный файл в списке, который появится при открытии окна Library и выборе опции View Post-Run Data (сверху). Нажать кнопку Analyse Data.

Расчёт количественного содержания генетически модифицированной сои в анализируемых образцах

Расчёт количественного содержания генетически модифицированной сои в анализируемых образцах проводится в программе ГМИ-квант на базе

131

Exсel, установленной на персональном компьютере. Действовать необходимо по алгоритму, различному для амплификаторов.

ДЛЯ АМПЛИФИКАТОРА ROTOR-GENE:

1.Открыть программу ГМИ-квант_шаблон. Макросы не отключать.

2.Сохранить файл c расширением Книга Microsoft Excel, указав дату анализа.

3.Перейти на лист Экспорт.

4.В окне Qant. results – Cycling A.FAM программы Rotor-Gene

скопировать столбец Name и перенести на лист Экспорт программы ГМИ-

квант в столбец Name поля FAM.

3.В окне Qant. Results – Cycling A.FAM программы Rotor-Gene

скопировать столбец Сt и перенести на лист Экспорт программы ГМИквант в столбец Сt поля FAM.

4.Проделать аналогичные манипуляции для ЭК Соя в окне Qant. results – Cycling A.JOE программы Rotor-Gene.

5.В программе ГМИ-квант перейти на лист Результаты.

6.В таблицу 1 в верхнем левом углу вставить значения среднее DCt

для каждого калибровочного стандарта, выбрав их из столбца среднее Ct. 7. После ввода последнего значения автоматически произойдет расчёт содержания ГМ сои в тестируемых образцах, и эти значения появятся в столбце %

ГМИ.

ДЛЯ АМПЛИФИКАТОРА ABI-PRISM 7000:

1.Открыть программу ГМИ-квант-7000_шаблон. Не отключать макросы.

2.Сохранить файл c расширением Книга Microsoft Excel, указав дату анализа.

3.Импортировать результаты анализа, нажав кнопку Import.

4.Нажать кнопку Sort.

5.В таблицу 1 в верхнем левом углу окна вставить значения среднее DCt

для каждого калибровочного стандарта, выбрав их из столбца среднее Ct.

6. После ввода последнего значения автоматически произойдет расчёт содержания ГМ сои в тестируемых образцах, и эти значения появятся в столбце % ГМИ.

ДЛЯ АМПЛИФИКАТОРА ICYCLER:

1.Открыть программу ГМИ-квант_шаблон. Не отключать макросы.

2.Сохранить файл c расширением Книга Microsoft Excel, указав дату анализа.

3.Перейти на лист Экспорт.

4.В окне PCR Quantification программы iCycler скопировать столбец Identifier (используя комбинаию клавиш Ctrl - C) и перенести на лист Экспорт программы ГМИ-квант в столбец Name поля FAM.

5.В окне PCR Quantification программы iCycler скопировать столбец Сt и перенести на лист Экспорт программы ГМИ-квант в столбец Сt поля FAM.

132