Ответы на экзамен по микробиологии 2022 года

Кривая бактериального роста (фазы размножения статической бактериальной культуры)

1.Лаг-фаза (начальная), 2 - 4 ч. Происходит адаптация бактерий к новым условиям культивирования, идёт синтез индуцибельных ферментов, увеличивается количество белка.

2.Лог-фаза (экспоненциальная), 5 - 12 ч. Максимальная скорость клеточного деления. Время генерации (время удвоения бактерии) постоянно в течение этой фазы, но вариабельно у различных видов.

При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 минут. Во время логфазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

3. Стационарная фаза. Продолжительность фазы зависит от вида бактерий и особенностей их культивирования, составляет несколько часов.

Количество особей в популяции максимальное. Количество погибших бактерий равно количеству образующихся.

4. Фаза ускоренной гибели (от 10 часов и более). Процессы гибели преобладают над процессом размножения, т.к. истощается питательный субстрат, накапливаются токсические продукты.

7. Питание бактерий. Типы и механизмы питания бактерий. Аутотрофы и гетеротрофы. Факторы роста. Прототрофы и ауксотрофы.

Питание – это процесс поступления питательных веществ в клетку, в результате чего происходит синтез структурных компонентов, обеспечивающих рост и размножение бактерий.

Пищевые потребности бактерий:

Макроэлементы (органогены): углерод, кислород, азот, водород.

Микроэлементы: калий, кальций, магний, натрий, сера, фосфор, хлор.

Ультрамикроэлементы: бор, вольфрам, железо, кобальт, цинк, медь, марганец…

Органические соединения: глюкоза…

Факторы роста бактерий: аминокислоты, липиды, витамины, пуриновые и пиримидиновые основания.

21

Питание необходимо для синтеза в клетке всех органических структур, оно осуществляется с поглощением энергии. Основным источником энергии являются окислительновосстановительные процессы (дыхание). По типу питания микробы делятся на аутотрофов и гетеротрофов. Аутотрофы усваивают азот и углерод из неорганических веществ (углекислый газ и др.), а гетеротрофы – из сложных органических соединений (аминокислоты, моносахариды и др.), синтезированных ранее другими живыми организмами. Гетеротрофы в свою очередь делятся на сапрофиты и паразиты. Сапрофиты нуждаются в органических соединениях мёртвого субстрата, а паразиты получают питательные вещества в организмехозяине. Паразиты могут быть облигатными (внутриклеточными) и факультативными. Облигатные внутриклеточные паразиты (хламидии) лишены способности жить и размножаться вне клеток хозяина, т.к. зависят от их метаболизма. Факультативные паразиты (гонококки, стафилококки и др.) могут питаться как в организме, так и вне его, поскольку обеспечены автономными ферментными системами при образовании веществ и энергии.

Прототрофы – микроорганизмы, не требующие для роста готовых витаминов, аминокислот или других факторов роста, они синтезируют их из минеральных или органических соединений.

Ауксотрофы – не способны синтезировать определённое органическое соединение, необходимое для их роста (нуждаются в питательных веществах в готовом виде).

Один и тот же микроорганизм может быть прототрофным по одному фактору роста, но ауксотрофным по другому фактору роста.

8. Питательные среды. Искусственные питательные среды: простые, сложные, общего назначения, элективные, дифференциально-диагностические.

Для культивирования бактерий применяют питательные среды. Они могут быть естественными (молоко, морковь, картофель), искусственными (готовят специально).

Требования к питательным средам:

питательность;

изотоничность: среда должна обладать определённым осмотическим давлением;

буферность: чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью (содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена);

оптимальная рН:

o для нейтрофилов pH = 7, o для ацидофилов pH < 7,

oдля алкалофилов pH > 7;

стерильность;

влажность: среда должна содержать воду;

унифицированность в отношении основных компонентов.

Взависимости от консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными (твёрдыми). Плотность среды достигается добавлением агара. Агар – полисахарид,

получаемый из водорослей.

22

По составу питательные среды могут быть простыми и сложными. К простым средам относятся пептонная вода, питательный бульон, мясопептонный агар. На основе простых сред готовят сложные среды, например, сахарный и сывороточный бульоны, кровяной агар.

В зависимости от назначения среды подразделяются на общего назначения, элективные и дифференциально-диагностические.

Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применения в качестве основы для приготовления специальных питательных сред. Например,

МПБ (мясо-пептонный бульон на основе говяжьего мяса) – базовая питательная среда для широкого круга микроорганизмов;

МПА (мясо-пептонный агар на основе говяжьего мяса) – базовая питательная среда для широкого круга микроорганизмов.

Под элективными понимают среды, на которых лучше растёт какой-то определённый микроорганизм. Например, щелочной агар, имеющий pH 9,0, служит для выделения холерного вибриона. Другие бактерии, в частности кишечная палочка, из-за высокого pH на этой среде не растут.

Дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результате ферментативного превращения субстрата. Примером таких сред являются среды Гисса, используемые для изучения способности бактерий ферментировать сахара.

9. Бактериологический метод изучения микроорганизмов. Принципы и методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.

Культура – микроорганизмы, выросшие на питательной среде.

Колония – видимое невооружённым взглядом скопление микробов на плотной питательной среде, выросшее из одной клетки. Колония – это потомство микробов, выросших из одной клетки. Т.к. все микробы в колонии выросли из одной клетки, они относятся к одному виду, т.е. в каждой изолированной колонии (отдельно стоящей, не сливающейся с другими колониями) содержится чистая культура.

Чистая культура – культура, содержащая микробы одного вида.

Штамм – чистая культура микробов, выделенная из определённого источника в определённое время.

Индикация – обнаружение возбудителя в исследуемом материале (определение рода).

Идентификация – определение вида, типа, биовара, серовара, фаговара выделенной чистой культуры.

Бактериологический метод является основным при диагностике инфекционных заболеваний. Его сущность заключается в определении вида возбудителя инфекции, следовательно, можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основной недостаток метода – длительность исследования – от 3х до 5ти суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление

23

направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдать ряд правил:

1.Забор исследуемого материала следует провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы антибиотика. Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды, необходимо соблюдать строжайшую антисептику. Для этого используют стерильный материал:

a.ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа);

b.проволочную петлю для взятия материала из влагалища, анального отверстия;

c.шприц для взятия крови, гноя;

d.стерильную посуду для непосредственного сбора в неё мочи, мокроты, испражнений.

2.Транспортировку полученного материала следует проводить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах.

3.Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

фамилия, имя, отчество, возраст пациента;

предполагаемый диагноз заболевания;

предшествующая антимикробная терапия;

характер материала;

дата и время взятия материала;

цель исследования;

название лечебного учреждения, номер отделения, палаты;

подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа.

1.Выделение чистой культуры возбудителя (1-2 суток). На первом этапе проводится посев исследуемого материала на плотную или жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар.

2.Идентификация чистой культуры (1-3 суток). Этап идентификации включает обязательное изучение морфологии, биохимических свойств и антигенной структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучение патогенных и персистентных свойств.

Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлёй в пробирку с твёрдой или, реже, жидкой питательной средой.

Характер роста микроорганизмов на плотных питательных средах

На поверхности плотной питательной среды отдельные бактериальные клетки, в том случае, если они распределяются изолировано друг от друга, при размножении образуют скопления, называемые колониями.

24

Внешний вид колоний характерен для каждого бактериального вида и может служить (ориентировочно) его диагностическим признаком.

Различают поверхностные, глубинные и донные колонии в зависимости от того, где они развивались – на поверхности плотной питательной среды, в толще её или на дне сосуда.

Исследуемую колонию характеризуют по следующим признакам: размер, форма, консистенция, цвет, контуры края и внутренняя структура.

Размер колонии определяется её диаметром. Различают точечные d < 1мм, мелкие d = 1-2 мм, средние d = 2-4 мм, крупные d = 4-6 мм и более.

Форма колонии – округлая, неправильная, ризоидная. У большинства бактерий обнаруживаются чаще всего два типа колоний.

Гладкие S-колонии, круглые, выпуклые, имеют ровные края и гладкую блестящую поверхность. Они образуются в том случае, если микробные клетки после деления соприкасаются своими поверхностями. Свое название они получили от английского слова smooth (гладкий). Большинство патогенных микроорганизмов образуют S- колонии.

Шероховатые R-колонии (от английского rough) характеризуются неправильной формой, зазубренными краями и морщинистой, шероховатой поверхностью. Формирование R- колоний обусловлено своеобразным делением бактерий, а именно наличием протоплазменных мостиков между разделившимися клетками и образованием цепочек, которые накладываются друг на друга. В результате разделившиеся бактерии имеют хаотическое расположение, что и создает неровные края и шероховатую поверхность.

Структура колоний может быть аморфной, зернистой, ветвистой или рассыпчатой.

Консистенцию колоний определяют, прикасаясь к её поверхности бактериологической петлёй. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей, волокнистой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петлёй).

Рельеф колонии – характеризуется приподнятостью её над поверхностью питательной среды. Различают куполообразные, конусовидные, плоские, кратерообразные колонии.

Характер края колонии – определяют при рассмотрении её под микроскопом. Различают ровные края в виде чётко выраженной линии, неровные волнистые, зубчатые, бахромчатые.

Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах

Характер роста микроорганизмов в жидких питательных средах менее разнообразен, чем на плотных. Различают:

1.Рост с равномерным (диффузным) помутнением жидкой среды – характерен для факультативных анаэробов, обладающих подвижностью.

2.Придонный рост с образованием осадка на дне пробирки дают анаэробные микроорганизмы. Осадок отличается по консистенции. Он может быть вязким, слизистым, хрупким. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды определяется наличием пигмента, продуцируемого

25

культурой микробов. Если культура пигмента не образует, цвет среды не изменяется, а осадок, как правило, бывает белого или жёлтого цвета.

3.Пристеночный рост бактерий проявляется в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя круглые или компактные зёрна, прикреплённые к внутренней поверхности стенок сосуда, с которых в зависимости от вида бактерий снимаются легко или с трудом.

4.Поверхностным ростом отличаются аэробные микроорганизмы. Они образуют плёнку различной плотности и консистенции на поверхности жидкой питательной среды. Цвет плёнки, как и питательной среды, зависит от пигмента, вырабатываемого растущей культурой микробов.

10.Особенности химического состава клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Клеточная стенка

Строение клеточной стенки Грам+ бактерий:

Пептидогликан имеет многослойную структуру.

Пептидогликан связан с тейхоевыми и липотейхоевыми кислотами.

Строение клеточной стенки Грамбактерий:

Наружная мембрана состоит из: o липополисахариды (ЛПС); o липопротеины;

o фосфолипиды; o белки-порины.

Пептидогликан представлен 1-2 слоями.

26

Периплазма (содержит ферменты и компоненты транспортных систем).

Липополисахарид – это эндотоксин Грамбактерий. Разрушение бактерий антибиотиками

приводит к освобождению большого количества эндотоксина, что может вызвать у больного эндотоксический шок.

Схема строение пептидогликана:

27

Функции клеточной стенки:

1.Скелетная (определяет и сохраняет постоянную форму клетки).

2.Защитная.

3.Рецепторная.

4.Антигенная (определяет антигенную специфичность бактерий, обладает важными иммунобиологическими свойствами).

5.Адгезивная.

6.Транспортная (обеспечивает связь с внешней средой через поры и каналы).

7.Образование L-форм бактерий при нарушении синтеза клеточной стенки.

Свойства L-форм бактерий:

1.L-трансформация индуцируется антибиотиками, ферментами и антимикробными антителами.

2.Превращение из Грам+ в Грамструктуру.

3.Изменение антигенных свойств.

4.Снижение вирулентных свойств, в связи с утерей адгезивных, инвазивных, эндотоксических свойств.

5.Способность длительно персистировать (переживать) в организме. Утрата клеточной стенки делает L-формы нечувствительными к различным химиопрепаратам и антителам.

6.Способность возвращаться в исходную бактериальную форму.

Окраска по методу Грама. Сущность метода:

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий.

У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются

28

поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

11. Способы получения энергии бактериями (брожение, дыхание). Типы дыхания бактерий. Методы культивирования анаэробов.

В зависимости от способа получения энергии у бактерий имеется несколько типов метаболизма: окислительный, или дыхание; бродильный, или ферментативный; смешанный. Тип метаболизма определяет не только реакции, в результате которых образуется АТФ, но и конечные продукты этих реакций, которые используются при идентификации бактерий, а также условия культивирования бактерий.

Дыхание – совершенный энергетический процесс получения энергии в реакциях окислениявосстановления (процесс окисления глюкозы до СО2 и Н2О).

Признаки дыхания:

высокий энергетический выход (36 молекул АТФ на 1 молекулу глюкозы);

мембранный тип фосфорилирования – реакции протекают в мезосомах;

акцептор электронов – кислород или неорганические вещества.

Процесс дыхания состоит из нескольких этапов:

1.Гликолиз – в цитоплазме клетки образуется ПВК и высвобождается 2 молекулы АТФ.

2.Цикл трикарбоновых кислот (Кребса) – в мезосомах ПВК окисляется до СО2 и Н2О, высвобождается 36 молекул АТФ.

3.Дыхательная цепь – в цитоплазматической мембране – электроны переносятся на акцептор.

Брожение – процесс окисления анаэробного типа, процесс расщепления глюкозы до пировиноградной кислоты под влиянием ферментов микроорганизмов.

Признаки брожения:

низкий энергетический выход (2 АТФ на 1 молекулу глюкозы);

субстратный тип фосфорилирования (реакции протекают в цитоплазме клетки);

продукты расщепления органического субстрата могут служить одновременно и донорами, и акцепторами водорода.

Взависимости от конечного продукта выделяют:

1.Спиртовое брожение – дрожжи.

2.Молочнокислое брожение – лактобактерии, бифидумбактерии, стрептококки.

3.Пропионовокислое брожение – пропионовокислые бактерии.

4.Маслянокислое брожение – спорообразующие бактерии.

Этапы брожения:

29

1.Окисление субстрата – глюкоза подвергается фосфорилированию при участии АТФ и АДФ, в результате образуется гексозодифосфат, который под действием ферментов превращается в ПВК.

2.Восстановление пирувата в конечные недоокисленные продукты брожения (спирт, масляная кислота, молочная кислота и др.), которые не могут использоваться клеткой в анаэробных условиях и выводятся.

Типы дыхания бактерий:

Облигатные (строгие) аэробы. Функционируют только в присутствии кислорода.

Микроаэрофилы. Нуждаются в кислороде в меньшей степени.

Факультативные анаэробы. Могут расти как при наличии, так и при отсутствии кислорода, поскольку способны переключаться с дыхания в присутствии молекулярного кислорода на брожение в его отсутствие. Факультативные анаэробы способны осуществлять анаэробное дыхание, называемое нитратным: нитрат, являющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекулярного азота и аммиака.

Облигатные анаэробы. Растут только на среде без кислорода, который для них токсичен. При наличии кислорода бактерии образуют перекисные радикалы кислорода, в том числе перекись водорода и супероксид-анион кислорода, токсичные для облигатных анаэробных бактерий, поскольку они не образуют соответствующие инактивирующие

ферменты (каталазу, пероксидазу). Среди облигатных анаэробов различают аэротолерантные бактерии, которые сохраняются при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.

Для культивирования облигатных анаэробов требуется исключить доступ кислорода воздуха. Для выращивания анаэробов в бактериологических лабораториях применяют анаэростаты – специальные ёмкости, в которых воздух заменяется смесью газов, не содержащих кислорода. Воздух можно удалять из питательных сред путём кипячения, с помощью химических адсорбентов кислорода, помещаемых в анаэростаты или другие ёмкости с посевами.

12. Ферменты бактерий. Классификация ферментов: 1) по химической природе; 2) по генетическому контролю. Методы изучения ферментативной активности бактерий и её использование для идентификации бактерий.

Ферменты (энзимы) – белковые катализаторы живой клетки. У бактерий обнаружены все 6 классов ферментов.

Свойства ферментов:

Ускоряют реакции (скорость реакций возрастает на несколько порядков).

Не входят в состав конечных продуктов реакции и не расходуются в процессе реакции.

Высокая специфичность, избирательно действуют на субстрат.

Регулируемы. Регуляция ферментативного аппарата – важнейший механизм адаптации к условиям среды.

Классификация ферментов по химической природе:

1.Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции. Играют большую роль в процессах получения энергии (дегидрогеназы, каталаза, цитохромы).

2.Трансферазы – ускоряют реакции переноса атомов в ЦТК, ПФП и др. Аденилтрансферазы и

ацетилтрансферазы определяют антибиотикорезистентность бактерий.

30