Развернутая реакция агглютинации
Развернутая реакция агглютинации используется как для определения антител и установления их титров в сыворотке крови, так и для определения антигенов (возбудителя).
Для определения антител и их титров в сыворотке крови к разведениям сыворотки крови добавляют антигенный диагностикум (взвесь известных убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными на них известными антигенами).
При определении возбудителя к разведениям известной агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Положительная реакция проявляется образованием хлопьевидного осадка.
1/20 |
1/40 |
1/80 |
1/160 |
1/320 |
1/640 |
Титр 1/160
Реакция латекс-агглютинации
Реакция агглютинации латекса или реакция латекс-агглютинации (РАЛ или РЛА) предусматривает использование латексного диагностикума. Латексный диагностикум представляет собой частицы латекса (полистирола), покрытые антигенами (латексный антигенный диагностикум) для выявления антител или антителами (латексный антительный диагностикум) для выявления антигенов.
Частицы латекса, нагруженные антигеном или антителами, используют в реакции определения неизвестного антигена по известной сыворотке или неизвестных антител по известному антигену. Реакция латекс-агглютинации проявляется в течение 2- 3 минут. Наступившая реакция латекс-агглютинации хорошо видна невооруженным глазом особенно на темном фоне или под малым увеличением микроскопа. При положительной реакции наблюдают образование фестончатого осадка - “розетки агглютинации”. При отрицательном результате отмечается образование “пуговки” (осевшие частицы латекса).
Частица
латекса
Частица
латекса
Антиген |
Антитело |
Антитело |
|
|
Антиген |
тело |
Патоген |
|
|
|
Антитело |
|
Антигенный и антительный диагностикумы
Результат реакции латекс-агглютинации
Реакция прямой гемагглютинации
Реакция прямой гемагглютинации представляет собой |
|
|
|
|
|
|
способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
них определенных антигенов. К реакциям прямой |
|
|
|
|
|
|
гемагглютинации относятся реакции определения групп |
|
|
|
|
|
|
крови в системе АВ0 и вирусная гемагглютинация. |
|
|
|
|
|
|
Например, вирусы гриппа способны спонтанно |
|
|
|
|
|
|
агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих в |
|
|
|
|
|
|
|
|
Эритроциты |
Вирусысы |
Гемагглютинация |
|
результате наличия на поверхности вирусных частиц |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
гемагглютинина. При добавлении таких вирусов к |
|
|
|
|
|
|
суспензии эритроцитов наблюдается образование |
|
|
|
|
|
|
сгустков, состоящих из эритроцитов и вирусных частиц. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Реакция непрямой гемагглютинации
Реакцию непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) проводят в двух вариантах: с известным антигеном для обнаружения антител и с известными антителами (сывороткой) для выявления неизвестного антигена. В РНГА используют эритроцитарные диагностикумы: эритроцитарный антигенный диагностикум (для обнаружения антител) или эритроцитарный антительный диагностикум (для обнаружения антигенов).
При постановке РНГА для определения титра антител в сыворотке крови используют агглютинационные пробирки или полистироловые планшеты. С этой целью к разведениям сыворотки крови больного добавляют эритроцитарный антигенный диагностикум. При положительной реакции склеенные антителами эритроциты выпадают на дно в виде фестончатого осадка (“перевернутого зонтика”). При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно в виде плотного осадка (“пуговки”).
|
1:20 |
1:40 |
1:80 |
1:160 1:320 11:640 Контроль |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
“Зонтик“ ”” “Пуговка“ ””
Реакция торможения гемагглютинации
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) широко используется при исследовании гемагглютинирующих вирусов. Она основана на том, что некоторые вирусы (в частности, вирусы гриппа) обладают гемагглютинирующей способностью за счет наличия у них гемагглютининов. При контакте таких вирусов с эритроцитами наступает гемагглютинация.
При наличии в сыворотке крови соответствующих антител гомологичный вирус связывается с этими антителами и утрачивает свою гемагглютинирующую активность. В результате этого вирусы нейтрализуются антителами и теряют способность агглютинировать эритроциты. В РТГА эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие в смеси свободного вируса, а отсутствие гемагглютинации (торможение гемагглютинации) - на нейтрализацию вируса антителами.
|
Эритроциты |
|
Вирусы |
|
|
|
|
|
Нейтрализация вирусов |
|
Эритроциты Антивирусные |
Вирусы |
|
Нейтрализация вирусов |
|
|
антитела |
|
антителами, |
|
|
|
антителами, торможение |
|
|
|
|
торможение гемагглютинации |
|
|
|
|
гемагглютинации |
296
Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA-тест) представляет собой метод, основанный на специфическом связывании антигена с антителом. При этом один из компонентов (антиген или антитело) конъюгирован (связан) с ферментом (так называемый конъюгат) - пероксидазой, щелочной фосфатазой или бета-галактозидазой. При добавлении в реакционную смесь хромогенного субстрата (вещества, меняющего цвет под влиянием фермента) образуется окрашенный продукт.
+ сыворотка крови больного |
+ меченая сыворотка против Ig человека (конъюгат)
+сыворотка больного
+диагностическая сыворотка против антигена
+ меченые антитела против |
диагностической сыворотки |
+ субстрат
Схема ИФА: слева – определение антител; справа – определение антигенов.
297
Разновидность ИФА - тест высвобождения гамма-интерферона
Тест высвобождения гамма-интерферона (Interferon-gamma release assays, IGRA). Суть этого теста заключается в том, что в организме, в котором идет инфекционный процесс, вызванный Mycobacterium tuberculosis, Т- лимфоциты под воздействием микобактериальных антигенов, специфичных именно для этого возбудителя, начинают выделять гамма-интерферон (INF-γ). В организме, где туберкулезного процесса нет, такой реакции не будет.
В России доступны 2 вида IGRA-тестов: QuantiFERON и T-SPOT.TB. Эти тесты различаются методикой учета результатов. QuantiFERON-тест определяет количество (концентрацию) гамма-интерферона в исследуемом образце. T-SPOT.ТВ-тест проводит подсчет количества клеток, выделяющих гамма-интерферон.
Для проведения IGRA-теста берут кровь пациента, выделяют лимфоциты, добавляют к ним микобактериальные антигены и определяют выделение Т-лимфоцитами гамма-интерферона. Для активации Т-лимфоцитов используют смесь 2 или 3 антигенов микобактерий, не встречающихся в вакцинном штамме БЦЖ и отсутствующих у нетуберкулезных микобактерий. Эти антигены присутствуют только у возбудителя туберкулеза человека (Mycobacterium tuberculosis) и у микобактерий “туберкулезного комплекса” (M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti).
Квантифероновый тест – QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus-тест)
Квантифероновый тест выявляет клеточный иммунный ответ на пептидные антигены, симулирующие микобактериальные протеины. Антигены, используемые в QFT- Plus-тесте, представляют собой смесь протеинов ESAT-6 и CFP-10. Эти антигены стимулируют образование гаммаинтерферона в Т-клетках лиц, инфицированных M. tuberculosis и микобактериями “туберкулезного комплекса”. Для проведения теста у пациента отбирают кровь и в плазме крови определяют наличие гамма-интерферона по методике ИФА в планшетах.
Отбор крови |
|
|
в пробирки |
Центрифугирование |
Отбор плазмы |
с антигенами |
крови |
Внесение плазмы и конъюгата в планшеты
Внесение |
Учет |
субстрата |
результатов |
Т-спот – тест (T-SPOT.TB)
Этот тест позволяет определять в крови количество Т-клеток (CD4 и CD8), вырабатывающих гамма-интерферон, который продуцируется в ответ на стимуляцию микобактериальными антигенами ESAT-6 и CFP-10.
В лаборатории из крови получают мононуклеары, которые инкубируют с микобактериальными антигенами ESAT-6 и CFP-10 для стимуляции клеток. Секретированный этими клетками гамма-интерферон связывается и удерживается специфическими антителами, находящимися в лунке, остальные клетки удаляются при промывании. Затем в лунки добавляются специфические антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой (конъюгат). Несвязавшийся конъюгат удаляется при промывании. После этого в каждую лунку добавляется субстрат, который расщепляется связанным ферментом. В месте реакции образуется пятно нерастворимого преципитата, соответствующее одной Т-клетке, секретирующей гамма-интерферон. Количество образующихся пятен является количественной характеристикой содержания сенсибилизированных микобактериями Т-клеток.
ВнесениеВнесениев лункиантигеновТ-клетоки Ти-клетокантигенов, . |
Интерферонсвязываетсязахватывается |
Т-клетки высвобождают |
. |
с антителами |
высвобождающих интерферон |
|
Добавлениеконъюгированныхс ДобавлениеДобавлениесубстратасубстрата, оценка, ферментомерментом антител к
с антител к интерферону результатовучет количествапо количествупятенпятен интерферону
