9. Антитоксические сыворотки: получение, очистка, контроль, титрование; условия хранения, в каких единицах измеряется биологическая активность антитоксических сывороток?

Для получения антитоксических сывороток проводят гипериммунизацию (многократное введение) лошадей токсинами. Иммунизацию проводят подкожно или внутривенно возрастающими дозами антигена с определенными интервалами времени между инъекциями. Вначале вводят анатоксин, а через 4 – 5 дней – токсин. Антитоксические сыворотки используют для создания антитоксического иммунитета, т.е. для лечения и профилактики токсинемических инфекций (ботулизма, столбняка, газовой гангрены, дифтерии).

Они называются гетерогенными т.к. содержат чужеродные для человека сывороточные белки. Более предпочтительным является применение гомологичных антитоксических сывороток, для получения которых используется сыворотка переболевших людей (коревая, паротидная), или специально иммунизированных доноров (противостолбнячная, противоботулинистическая), сыворотка из плацентарной а так же абортивной крови, содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания. Для очистки и концентрирования антитоксических сывороток используют методы: осаждение спиртом или ацетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация. Активность иммунных антитоксических сывороток выражают в антитоксических единицах, т. е. тем наименьшим кол-вом антител, которое вызывает видимую или регистрируемую соответствующим способом реакцию с определённым кол-вом специфического антигена. Активность антитоксической противостолбнячной сыворотки и соответствующего Ig выражается в антитоксических единицах. Антитоксические сыворотки применяются для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена). После введения антитоксических сывороток возможны осложнения в виде анафилактического шока и сывороточной болезни, поэтому перед введением препаратов ставят аллергическую пробу на чувствительность к ним пациента, а вводят их дробно, по Безредке

Сыворотки подвергают очистке и концентрации методом «Диаферм-3»,контролю на безвредность, апирогенность, затем титруют т. е. определяют содержание антитоксинов в 1 мл препарата. Специфическая активность сывороток или количество антител измеряется с помощью специальных методов, основанных на способности сывороток in vitro и in vivo нейтрализовать соответствующие токсины и выражается в международных антитоксических единицах (ME), принятых ВОЗ. За 1 ME принимается то минимальное количество сыворотки, которое способно нейтрализовать определенную дозу токсина, выражающуюся в стандартных единицах, обозначаемых как смертельные, некротические или реактивные дозы в зависимости от вида токсина и способа титрования.

Титрование антитоксических сывороток может проводиться тремя методами — методами Эрлиха, Рёмера, Района. Титрование сывороток по методу Района осуществляется с помощью реакции флоккуляции по известному анатоксину или токсину, 1 Lf (Limes flocculationis —порог флоккуляции) которых нейтрализует 1 единица дифтерийного антитоксина. Первичная или инициальная реакция флоккуляции наступает при соответствии количества антигенных единиц анатоксина количеству антитоксинов в исследуемой сыворотке. Исходя из результатов первичной реакции флоккуляции и ведется расчет антитоксических единиц в 1 мл испытуемой сыворотки. Однако метод Рамона является только ориентировочным.

Метод Эрлиха. Перед титрованием сывороток по методу Эрлиха проводят определение условной смертельной (опытной) дозы токсина Lt (Limes tod). Lt определяется с помощью стандартной антитоксической сыворотки, к определенному количеству которой добавляют различные объемы токсина и после выдерживания смеси при комнатной температуре (в течение 45 минут) вводят белым .мышам или морским свинкам. Затем наблюдают за животными четверо суток. За опытную дозу токсина (Lt) принимается то количество токсина, которое в смеси с 1 ME стандартной сыворотки вызывает гибель 50% взятых в опыт животных.

На 2ом этапе титрования к различным разведениям испытуемой сыворотки добавляют опытную дозу токсина, смесь также выдерживают и вводят животным. По получаемым результатам производят расчет титра испытуемой антитоксической сыворотки.

Метод Рёмера. Титрование антитоксических сывороток по методу Рёмера проводится также в 2 этапа, но является более экономичным, т. к. опыт проводится на 1ом животном. Предварительно определяется опытная некротическая доза токсина — Ln (limes necrosis) введением внутрикожно морской свинке различного количества токсина со стандартной сывороткой. За некротическую дозу токсина принимается то его наименьшее количество, которое при внутрикожном введении морской свинке в смеси с 1/50 ME стандартной противодифтериной сыворотки вызывает на месте введения некроз на 4—5-й день. Затем различные объемы испытуемой сыворотки в смеси с оттитрованной некротической дозой токсина вводятся внутрикожно морской свинке и по результатам проводится расчет титра сыворотки. По методу Рёмера титруется противодифтерийная сыворотка.

10. Какой вид иммунитета создаётся при введении их в организм, какова продолжительность иммунитета? Назовите антитоксические сыворотки, применяемые на практике.

При введении антитоксических сывороток создается искусственный пассивный приобретенный иммунитет, кратковременный эффект.

1. Противодифтерийную сыворотку получают гипериммунизацией лошадей дифтерийным анатоксином и применяют, главным образом, с терапевтической целью. Сыворотку вводят подкожно или внутримышечно.

2. Противостолбнячная сыворотка представляет собой препарат, получаемый из сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных столбнячным анатоксином или токсином.

3. Противогангренозные моно- и поливалентные сыворотки получают гипериммунизацией лошадей анатоксинами или токсинами возбудителей газовой гангрены (Cl. perfringens, C1.oedematiens, Cl. septicum). Противогангренозные сыворотки применяются для лечения и профилактики газовой гангрены. С профилактической целью сыворотку вводят внутримышечно, с лечебной — внутривенно, очень медленно, капельным методом.

4. Противоботулинические антитоксические сыворотки А,В, Е получают от лошадей, гипериммунизированных анатоксинами соответствующих типов, и выпускают в виде моновалентных сывороток, включающих по 1 ампуле сыворотки каждого типа, или в виде поливалентной сыворотки, содержащей в ампуле антитела ко всем 3 типам токсинов клостридий ботулизма.

11. Какие осложнения могут возникуть при введении лечебных сывороток? Схема введения гетерологичных сывороток человеку.

Осложнения: 1) анафилактический шок. Развивается чаще всего при повторном парентеральном введении сывороток и вакцин. Относится к общей аллергической реакции немедленного типа. Степень выраженности симптомов шока может быть различной - от легких проявлений до молниеносных смертельных форм.

2)сывороточная болезнь. Является проявлением аллергической ре­акции организма на введение чужеродного белка, чаще всего лошадиного.

3) неврологические осложнения. Проявляются в форме поражения центральной и периферической нервной систе­мы.

Техника выполнения: NB! Для предупреждения анафилактического шока первое введение сыворотки проводится дробно по методу Безредко!

Проверить наименование сыворотки, срок годности, внешний вид, целостность ампулы, дозу. Перед введением сыворотку подогреть до температуры 37°С.

I этап. Определение чувствительности организма к чужеродному белку с помощью внутрикожной пробы. 1. Обработать ампулу с разведенной сывороткой 1:100 (ампула с красной маркировкой), согласно алгоритма набора лекарственных средств из ампулы.

3. Набрать дозу разведенной сыворотки в туберкулиновый шприц 0,1 мл.

4. Обработать двукратно среднюю треть ладонной поверхности предплечья 70% спиртом.

5. Натянуть кожу в месте инъекции, обхватив предплечье пациента снаружи.

6. Расположить шприц почти параллельно коже и ввести в кожу иглу на глубину ее среза.

7. Ввести сыворотку. При правильном введении на месте инъекции образуется беловатая папула («пуговка»), имеющая вид лимонной корочки, которая исчезнет через 10-15 минут.

8. К месту инъекции приложить сухой стерильный шарик, не давить.

9. В предплечье второй руки вводят в/к 0,1 мл физиологического раствора в качестве контроля.

10. За реакцией наблюдают 20-30 мин. Если диаметр, образующийся на месте инъекции папулы, не превышает 0,9см, а гиперемия вокруг нее небольшая, проба считается отрицательной.

II этап. Лечебное введение цельной сыворотки. 1. Обработать ампулу с цельной сывороткой (ампула с синей маркировкой), согласно алгоритма набора лекарственных средств из ампулы.

2. Набрать дозу цельной сыворотки в шприц 0,1 мл.

3. Обработать двукратно среднюю треть наружной поверхности плеча 70% спиртом.

4. Осуществить подкожное введение цельной сыворотки: собрать кожу одной рукой в складку треугольной формы основанием вниз. Ввести шприц под углом 45°. Ввести сыворотку.

5. К месту инъекции приложить стерильный шарик смоченный спиртом.

6. За пациентом наблюдают 20-30 мин. При отсутствии общей реакции приступают к 3 этапу.

III этап. Лечебное введение сыворотки. 1. Набрать заданную дозу цельной сыворотки в шприц из ампулы с синей маркировкой.

2. Обработать двукратно наружный верхний квадрант ягодицы 70% спиртом.

3. Осуществить внутримышечное введение цельной сыворотки. Ввести шприц под углом 90°. Ввести сыворотку.

4. К месту инъекции приложить стерильный шарик смоченный спиртом.

5. За пациентом наблюдают 1 час.

12. Иммуноглобулины: получение, очистка и концентрация; какое преимущество имеет иммуноглобулины перед сыворотками? Виды иммуноглобулинов, источники их получения. Приведите примеры.

Иммуноглобулины или их фрагменты получают методами солевого фракционирования и ферментной обработки, с использованием различных методов очистки от балластных белков и примесей (хроматографии, мембранной фильтрации, ферментации и других соответствующих химических и физических методов), обеспечивающих получение продукта, свободного от контаминации, агрегатов и фрагментов сывороточных белков, влияющих на безопасность и качество. Технологический процесс получения иммуноглобулинов или их фрагментов должен быть валидирован. Для продуктов, представленных фрагментами иммуноглобулина, для гарантии регламентированной фрагментации указывают методы, подтверждающие правильность установленных нормативных требований.

Классы и подклассы моноклональных иммуноглобулинов, секретируемых специфическими гибридомами, определяют прямым методом ИФА

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе, позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки.

При иммунохимическом исследовании вирусов растений успешно использовались иммунизированные цыплята и яичный желток как источник антител, а не иммунная сыворотка. Этот метод позволяет в короткое время получать значительное количество антител он облегчает очистку иммуноглобулинов IgG позволяет избежать кровопускание у животных.

Таким образом можно получить сотни или тысячи гомогенных иммуноглобулинов. Очистка их производится при помощи аффинной хроматографии. Иммуноадсорбенты для этой цели готовятся введением нужного сахарного остатка в молекулы подходящих носителей—сефарозы, бромацетилцеллюлозы

Ig G составляют 70% всех иммуноглобулинов человека. По строению - мономеры. Появляются они на более поздних сроках после первичной антигенной стимуляции, при вторичном иммунном ответе это основной класс продуцируемых антител. Находятся они как в крови, так и вне сосудов. Ig G – единственный, кто активно транспортируется через плаценту и играет важную роль в защите новорожденного от инфекции в первые месяцы жизни. Он является активатором системы комплемента. Валентность его равна 2. У человека различают в сыворотке крови 4 субкласса (подкласса) IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), которые различаются по строению тяжелых цепей (γ1, γ2, γ3, γ4) и некоторыми функциями. Концентрация в сыворотке от 7,0 до 22 г/л.

Ig М в сыворотке крови представлен в виде пентамера. В молекуле IgM 5 структурных молекул (подобных IgG) расположены радиально. Fc-фрагменты направлены в центр, где соединены J-цепью (от англ. joining – соединение), а Fab фрагменты - наружу. Тяжелые (Н) цепи состоят из 5 доменов, так как содержат 4 константных домена. Ig M обладает высокой комплементсвязывающей активностью, так как имеет 5 центров активации комплемента в СН2 доменах. Синтезируется в основном при первичном иммунном ответе и преимущественно содержится Мембрана клетки FcR во внутрисосудистом русле. Количество Ig M в сыворотке крови здоровых составляет 0,48 - 2,0 г/л., т.е. около 10% от общего количества Ig. Концентрация IgM в сыворотке крови у пожилых несколько снижается.

Ig A составляет 10 — 15% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови. Не обладает способностью активировать комплемент. Большая часть сывороточных Ig A (80%) имеет мономерную структуру. Имеется 2 субкласса (IgA1, IgA2). Менее 20% Ig A в сыворотке представлено димерными молекулами. Концентрация Ig А в сыворотке крови взрослого 0,7 – 5,0 г/л. Ig A синтезируется плазматическими клетками, находящимися преимущественно в подслизистых тканях, на слизистой эпителиальной поверхности дыхательных путей, урогенитального и кишечного тракта, почти во всех экскреторных железах. Часть Ig А попадает в общую циркуляцию, но большая его часть секретируется местно на слизистых оболочках в виде sIgA и служит местным защитным иммунологическим барьером слизистых. Сывороточный IgA и sIgA это различные иммуноглобулины! SIgA нет в сыворотке крови. Ig E содержится в сыворотке в очень небольшом количестве. Ig E не активирует систему комплемента. Его особенность состоит в том, что он СПОСОБЕН ФИКСИРОВАТЬСЯ НА БАЗОФИЛАХ И ТУЧНЫХ КЛЕТКАХ, что объясняется наличием в большом количестве на указанных клеткахù рецепторов к Fc-фрагментам Ig E. При последующем соединении фиксированных на тучных клетках или базофилах Ig E с антигеном возникает дегрануляция этих клеток с высвобождением гистамина. Ig E называют цитофильным иммуноглобулином, или РЕАГИНОМ за способность фиксироваться на названных клетках. Он играет ведущую роль в патогенезе аллергических заболеваний (1 тип) и в противогельминтном иммунитете. Концентрация в сыворотке здоровых людей 0,000014 – 0,00045 г/л. Ig D обнаруживается в сыворотке в малых количествах (0,02 - 0,04 г/л) и его роль как сывороточного иммуноглобулина не совсем ясна. Как рецепторный, Ig D находится на В-лимфоцитах, причем он появляется на мембране относительно зрелых клеток, поэтому его наличие является свидетельством зрелости В-лимфоцитов

13. Как вводят гетерологичные иммуноглобулины, почему? Что такое аллергия? Типы аллергических реакций, их механизм.

Для лечения хронических, рецидивирующих инфекций применяют иногда лечение вакцинами. Это стимулирует иммунитет у данного больного. Для вакцинотерапии применяют либо стандартные убитые лечебные вакцины (гонококковая, бруцеллезная, стафилококковая), либо вакцину, приготовленную из штамма, выделенного от данного больного (аутовакцину).

Аллергия – это состояние организма, при котором иммунная система видит угрозу в веществах, на самом деле не представляющих опасность для человека. Иммунитет считает их антигенами, поэтому начинает вырабатывать против них антитела. В этот период человек и начинает ощущать, что организм борется с болезнью, что проявляется неприятными симптомами. В реальности же настоящих возбудителей болезни нет. Такая повышенная чувствительность организма к отдельным веществам (аллергенам) и называется аллергией.

Анафилактический (I тип)¹. Аллерген, попав в организм впервые, вызывает появление специфических антител (иммуноглобулинов типа Е — IgE), которые фиксируются на поверхности тучных клеток. Это состояние называют сенсибилизацией. При повторном контакте уже сенсибилизированного организма с раздражителем происходит IgE-зависимая активация тучных клеток. Это вызывает выброс гистамина, гепарина и других медиаторов воспаления, ответственных за проявление аллергических реакций.

Причиной аллергических реакций I типа чаще всего становятся компоненты пыльцы растений (трав, цветов, деревьев), бытовые, эпидермальные и пищевые аллергены, некоторые лекарственные средства, а также чужеродные сыворотки крови.

По I типу протекают анафилактический шок, аллергический ринит, атопическая бронхиальная астма, атопический дерматит, аллергическая крапивница и отек Квинке, анафилактические реакции, например на продукты питания, укусы насекомых и ряд других⁶.

Цитотоксический (II тип) При таком типе реакции антитела действуют против веществ, которые заранее прикрепились к клеткам собственных тканей организма. В результате запускается процесс их гибели. Именно по этой причине II тип аллергических реакций и получил название цитотоксического¹.

Антигенами же при этом типе реакций чаще всего выступают бактериальные, вирусные и другие инфекционные аллергены, аутоаллергены и лекарства⁶. По II типу может протекать лекарственная аллергия, такая же реакция возникает иногда и при переливаниях крови: организм считает попавшие в него клетки чужими и обороняется от них¹.

Иммуннокомплексный (III тип). Характеризуется образованием комплексов аллергена с антителами, которые активируют высвобождение медиаторов, повреждающих окружающие ткани. Такая реакция может развиваться в ответ на пищевые, лекарственные, ингаляционные, вирусные и бактериальные аллергены и антитоксические сыворотки¹,⁷. Заболевания, обусловленные реакцией III типа: сывороточная болезнь, лекарственная аллергия и аутоаллергические заболевания (ревматоидный артрит, системная красная волчанка)¹,⁷.

Гиперчувствительность замедленного типа (IV тип). В ответ на попадание аллергена образуются сенсибилизированные Т-лимфоциты. На их поверхности есть рецепторы, способные взаимодействовать с соответствующими антигенами. При повторном попадании аллергена они соединяются с сенсибилизированными лимфоцитами, что ведет к выделению медиаторов — лимфокинов, из-за которых появляются симптомы аллергии. Причинами реакции IV типа могут быть компоненты различных микроорганизмов, паразитов, грибов, гельминтов, вирусов, а также вирус-содержащие и опухолевые клетки, собственные, но измененные белки организма или чужеродные протеины, гаптены⁸.

Самый простой пример такого рода реакции — проба Манту, с которой сталкивался, наверное, каждый⁹. Врачи проводят тесты на наличие антител, как раз вооружившись знаниями о гиперчувствительности замедленного типа.

14. Какие явления относятся к аллергическим реакциям замедленного типа? Аллергические диагностические пробы: что вводят при постановке реакции, что наблюдается при положительной реакции, что означает положительная реакция?

Аллергическая реакция IV типа, или аллергическая реакция замедленного типа (гиперчувствительность замедленного типа), при которой роль АТ выполняют сенсибилизированные Т-лимфоциты, имеющие на своих мембранах специфические рецепторы, способные взаимодействовать с сенсибилизирующими АГ. При соединении лимфоцита с аллергеном выделяются медиаторы клеточного иммунитета — лимфокины, вызывающие скопление макрофагов и других лимфоцитов, в результате чего возникает воспаление. Реакции замедленного типа развиваются в сенсибилизированном организме через 24–48 часов после контакта с аллергеном. Клеточный тип реакции лежит в основе развития вирусных и бактериальных инфекций (туберкулез, сифилис, лепра, бруцеллез, туляремия), некоторых форм инфекционно-аллергической бронхиальной астмы, ринита, трансплантационного и противоопухолевого ­иммунитета. Реакция считается положительной при появлении покраснения конъюнктивы, слезотечения и зуда век. Назальную провокационную пробу проводят при аллергических ринитах и поллинозах: в одну половину носа закапывают аллерген, в другую - контрольную жидкость.

АЛЛЕРГИЧЕСКИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРОБЫ (греческий allos — другой и ergon — действие) — методы диагностики аллергических заболеваний и заболеваний с аллергическим компонентом в патогенезе. Пробы основаны на местной или общей реакции сенсибилизированного организма в ответ на введение специфичного аллергена.

При диагностике аллергических заболеваний в процессе сбора анамнеза выделяют предполагаемую группу аллергенов, которые могли вызвать у больного состояние гиперчувствительности. С этими аллергенами проводят Аллергические Диагностические Пробы вне фазы обострения болезни. Применяют кожные, провокационные и элиминационные Аллергические Диагностические Пробы.

Кожные пробы  — наиболее безопасный и простой вид аллергических диагностических проб в зависимости от способа введения аллергена существуют аппликационные, скарификационные и внутрикожные пробы

Кожные Аллергические Диагностические Пробы используют и при некоторых инфекционных и паразитарных заболеваниях, сопровождающихся аллергической сенсибилизацией организма. При диагностике туберкулеза применяют скарификационную пробу Пирке и внутрикожную пробу Манту. При диагностике бруцеллеза применяют внутрикожную пробу Бюрне; аллергеном служит раствор бруцеллина, содержащий антигенный набор 3х различных возбудителей бруцеллеза. При диагностике эхинококкоза применяют внутрикожную пробу Касони. Аллергеном служит вытяжка из содержимого пузыря эхинококка. При положительной реакции в месте инъекции аллергена развивается воспалительная реакция с гиперемией и отечностью. При диагностике туляремии применяют внутрикожную пробу с тулярином (убитая нагреванием взвесь бактерий), при диагностике дизентерии — пробу с дизентерином Цуверкалова. Некоторые пробы применяют для выявления предрасположенности к инфекционным заболеваниям: реакцию Дика — при диагностике скарлатины, реакцию Шика — в диагностике дифтерии.

15. Назовите заболевания, при которых ставятся аллергические диагностические пробы (как называется проба, как называется аллерген). Что такое лекарственная аллергия, её формы, как она проявляется? Как выявляют повышенную чувствительность к антибиотикам?

Аллергические пробы (накожные и внутрикожные) получили всеобщее признание в диагностике таких бактериальных инфекций, как туляремия, бруцеллез (проба Бюрне), туберкулез (накожная проба Пиркета и внутрикожная проба Манту) токсоплазмоз, грибковые поражения кожи, сап и риккетсиозы (лихорадка Ку). Наиболее проста для выполнения накожная аллергическая проба в сравнении с внутрикожной и другими способами введения аллергена.

Лекарственная аллергия – это гиперчувствительность к определенным лекарственным препаратам, характеризующаяся развитием иммунной реакции в ответ на повторное проникновение в организм даже минимального количества аллергена. Проявляется симптомами поражения кожных покровов, бронхолегочной системы и других внутренних органов, кровеносных сосудов и суставов. Возможны системные аллергические реакции.