3. Контроль живых вакцин. Приведите примеры. Инактивированные вакцины: что содержат, из каких штаммов готовятся; этапы приготовления, консерванты; контроль инактивированных вакцин; что такое титр их?

Живые вакцины - это биологические препараты, содержащие штаммы вирусов, утратившие способность вызывать клинически выраженное заболевание, но сохранившие способность репродуцироваться в организме восприимчивого животного и стимулировать выработку специфических факторов противовирусного иммунитета (антител).

Основной этап - получение аттенуированных (слабовирулентных) штаммов вирусов. Основные трудности связаны с получением стабильного иммуногенного вакцинного штамма вируса и разработкой методов его контроля.

Для изготовления живых вакцин используют селекционированные естественные, аттенуированные и гетерологические штаммы вирусов. Естественные (выделенные из природы) авирулентные или слабовирулентные штаммы - это спонтанные мутанты, утратившие способность вызывать заболевание, но сохранившие иммуногенные свойства. Аттенуированные, т. е. ослабленные экспериментатором штаммы это индуцированные мутанты. Их обычно получают в лабораториях путем целенаправленного воздействия на эпизоотические штаммы различными физическими и химическими мутагенами или чаше путем пассажей вирулентного вируса через гетерологические (маловосприимчивые) биологические системы. живые вакцины могут содержать и «дикий» тип вируса, т. е. неослабленный вирус, но в таком случае его вводят в организм неестественным путем, в результате чего ограничивается репликация вируса в месте введения, вызывается лишь бессимптомная инфекция, заканчивающаяся выработкой иммунитета.

Любой вакцинный штамм должен быть хорошо изучен, классифицирован, клонирован и паспортизирован. В паспорте указываются основные генетические признаки, выявляемые, постоянно воспроизводимые и контролируемые в процессе поддержания его жизнеспособности и хранения (остаточная вирулентность, способность репродуцироваться, активность в конкретной биологической системе, особенности проявления инфекционного действия, спектр гемагглютинации, степень чувствительности к физическим и химическим факторам). Вакцинные вирусные штаммы должны обладать генетической и фенотипической стабильностью. Их приживаемость в привитом организме должна быть выраженной, а способность к репродукции ограниченной. Эти признаки должны быть наследственно закрепленными. Вакцинные штаммы не должны подвергаться реверсии (возврату в исходное состояние) в том числе и при пассажах на естественно восприимчивых животных. Они не должны вызывать специфического инфекционного процесса у животных после введения им массивных доз вакцинного штамма (в 5—10 раз превышающих иммунизирующую дозу). Живые вакцины должны создавать напряженный иммунитет не менее чем у 70% однократно вакцинированных животных, этого достаточно для создания условий, препятствующих дальнейшему распространению болезни в неблагополучном стаде. Вакцинные штаммы размножаются в привитом организме до тех пор, пока его защитные механизмы не затормозят их развитие.

Технология изготовления живых вакцин сводится к культивированию вакцинного штамма в какой-либо биологической системе, накоплению вируса, очистке и концентрации, расфасовке, лиофилизации и контролю готового препарата.

Для предупреждения размножения бактерий, случайно попавших во время сбора и расфасовки вируссодержащего материала, в состав живых вакцин иногда включают антибиотики. Для профилактики контаминации живых авианизированных вакцин микоплазмами и вирусами применяют прединкубационную термообработку яиц при 42—45°С в течение 4 - 7 часов с последующим переводом их на обычный режим инкубации, кроме того, для инактивации вирусов лейкозов готовые вакцины выдерживают при 4°С не менее 4 недель. Наиболее желательно для изготовления живых вакцин использовать чистые биологические системы: эмбрионы и эмбриональные культуры клеток японских перепелок или кур, свободных от специфических патогенных факторов. Выпускаются живые вакцины, как правило, в лиофильно высушенном виде. В процессе высушивания активность вирусов не должна снижаться более чем в 10-15 раз, что обеспечивается за счет добавок стабилизирующих веществ.

В живой вакцине вирус сохраняет потенциальную способность изменяться в сторону снижения антигенности или повышения реактогенности, или даже вирулентности.

ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ ШТАММАМ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЖИВЫХ ВАКЦИН 1. Производственные штаммы для изготовления живых вакцин должны быть аттенуированными, безвредными для естественно восприимчивых животных определенных возрастов, высокоиммуногенными, характеризоваться умеренной реактогенностью, иметь генетические маркеры, обеспечивающие их дифференциацию от эпизоотических штаммов.

2. Вакцинный штамм не должен ревенсировать в вирулентное состояние. Стабильность аттенуации определяют по изменению величины ЛД50 для чувствительных модельных или естественно восприимчивых животных после 5-кратных последовательных пассажей через организм.

3. Вакцинный штамп должен быть охарактеризован по способности диссеминации в организме, органотропности, срокам и путям элиминации.

4. Степень безвредности вакцинного штамма оценивают по величине переносимой дозы для вакцинируемых животных и животных других видов. При необходимости проверяют абортогенные свойства. Штамм не должен представлять опасность заражения животных других видов и человека.

5. Реактогенность штамма определяют по наличию у привитых животных общей температурной и местной воспалительной реакций, а также по другим показателям клинического состояния животных.

6. Иммуногенность вакцинных штаммов определяют по ИМД50 для лабораторных животных и оптимальной иммунизирующей дозе для сельскохозяйственных животных; устанавливают корреляцию между этими показателями.

7. При множественности антигенных вариантов вакцинный штамм должен быть охарактеризован по степени иммуногенности против гомологических и гетерологических сероваров.

8. Вакцинный штамм (живая вакцина) должен быть охарактеризован по продолжительности индуцируемого иммунитета у вакцинированных оптимальной дозой животных различных возрастных групп.

ТРЕБОВАНИЯ К КОНТРОЛЬНЫМ ШТАММАМ 1. Контрольные штаммы используют для проверки специфической активности вакцин, анатоксинов, гипериммунных и диагностических сывороток.

2. Контрольные штаммы, используемые для проверки вакцин и сывороток должны соответствовать по своим антигенным свойствам возбудителям болезни, против которой применяется биопрепарат.

3. Контрольный штамм должен быть охарактеризован по величине ЛД50 для восприимчивых лабораторных животных и летальной дозе для вакцинируемого поголовья сельскохозяйственных животных.

Инактивированные вакцины - готовятся из инактивированных вирулентных штаммов бактерий и вирусов. Это сложные по составу препараты. Производство их требует большого количества вируса.

В изготовлении инактивированных противовирусных вакцин с каждым годом проблема сырья (биологической системы, в которой репродуцируется вирус) приобретает все более острый характер. Все возрастающие трудности получения первичной культуры почечных и тестикулярных клеток для репродукции вирусов (инфекционного ринотрахеита, рота-, аденоинфекции, вирусной диареи крупного рогатого скота) побуждает исследователей получить чувствительные к этим вирусам перевиваемые линии клеток. Среди 1ых инактивированных вирусных вакцин были вакцины против бешенства, желтой лихорадки, ящура, классической чумы свиней, чумы плотоядных, ньюкаслской болезни и оспы животных.

Для получения вакцин, сывороток и препаратов для животноводства и сельского хозяйства используются как живые ослабленные или видоизмененные возбудители, так и убитые клетки, либо их отдельные части (антигены), которые вводятся во время прививки в здоровый организм, чтобы с профилактической целью научить его вырабатывать антитела. Вакцина - это собственно возбудитель (антиген), а сыворотка - полученные на антиген готовые антитела, вводимые уже заболевшему животному для быстрого ответа на инфекцию.

Основное требование, предъявляемое к инактивированным вакцинам - полная и необратимая инактивация генома при максимальной сохранности антигенной детерминанты (цепей полипептидов, вызывающих образование специфических антител и цитотоксических лимфоцитов) и иммунная защита привитых животных. Т к иммунный ответ обусловлен главным образом белками оболочки вириона или белками, экспрессированными на плазматической мембране зараженной клетки, то эти соединения в условиях инактивации генома либо вообще не должны подвергаться изменениям, либо эти изменения должны лишь в незначительной степени влиять на иммунный ответ организма.

Для инактивации микроорганизмов применяют нагревание, обработку формалином, ацетоном, фенолом, ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком, спиртом. Такие вакцины не опасны, они менее эффективны по сравнению с живыми, но при повторном введении создают достаточно стойкий иммунитет.

В процессе производства вакцины вирусные частицы разрушаются и впоследствии не могут самовоспроизводиться, однако вирусные капсидные белки достаточно сохранны, чтобы быть распознанными иммунной системой реципиента и вызвать ответную реакцию. Если технология производства строго соблюдается, то такая вакцина не способна вызвать инфекционное заболевание. Тем не менее, ненадлежащая инактивация может привести к сохранению целости инфекционных частиц. Поскольку вакцина является убитой, она не способна обеспечить надлежащим образом выработку иммунитета — необходимо периодически усиливать иммунный ответ многократным повторным её введением.

ТРЕБОВАНИЯ К ПРОИЗВОДСТВЕННЫМ ШТАММАМ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ВАКЦИН, АНАТОКСИНОВ И ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК 1. Штаммы д б клонированы и иметь типичные для вида (серовара) антигенную структуру, морфологические, культурные, ферментативные и др биологические св-ва, обладать выраженными иммуногенностью, вирулентностью или токсигенностью.

2. Питательная среда, на которой культивируется производственный штамм, должна обеспечить типичный рост, высокий уровень накопления микробов или их токсинов с полноценной антигенной структурой.

3. Вирулентность и иммуногенность штаммов определяют по величине 50%-ной летальной дозы (ЛД50) и 50%-ной иммунизирующей дозы (ИМД50) для восприимчивых лабораторных или сельскохозяйственных животных.

4. Окончательная оценка иммуногенности штаммов, отобранных для изготовления инактивированных вакцин, производится по устойчивости животных к заражению контрольным штаммом после вакцинации их инактивированным препаратом, изготовленным из испытуемого штамма или по нарастанию титра антител.

5. Штаммы микробов в лиофилизированном состоянии должны сохранять при минусовых температурах (в соответствии с паспортными данными) свои основные свойства, зафиксированные в паспорте в течение не менее 12 месяцев.

Титр вакцины – это максимальное разведение вакцины, которые способно вызвать иммунный ответ организма.

4. Условия хранения. Приведите примеры. Химические вакцины: определение понятия, приведите примеры. Понятие об адъювантах, смысл их применения.

Инактивированные вакцины в качестве действующего начала включают убитые тем или иным способом микроорганизмы (бактерии, вирусы)

Для инактивации микроорганизмов обычно используют формальдегид, спирты, фенол, температурное воздействие, УФ-облучение, ионизирующую радиацию и другие физические или химические методы. Получают инактивированные вакцины путем выращивания микроорганизмов на искусственных питательных средах (бактерии) или культурах клеток. После инактивации тем или иным методом проводят выделение антигенных комплексов, их очистку, при необходимости -- лиофилизацию. В препарат добавляют консервант, иногда - адъюванты.

Примеры инактивированных вакцин: Вакцина против гриппа, убитая вакцина против гриппа, убитая вакцина против полиомиелита, вакцина против бешенства и др. вакцины против особо опасных инфекций.

Применяются такие вакцины, как правило, в виде нескольких инъекций на курс вакцинации.

Химические вакцины, в отличие от живых и убитых, не содержат микробных тел. Они содержат наиболее иммуногенные антигены, извлечённые тем или иным способом из микробных клеток. К ним относятся вакцины: брюшнотифозная (содержит О-антиген бактерий брюшного тифа, адсорбированный на гидроокиси алюминия), менингококковая (содержит капсульный полисахарид менингококка серогруппы А, В), холерная.

Химические вакцины содержат наиболее активные по иммунологическим свойствам специфические компоненты – антигены, которые извлекают из микробных клеток химическими методами.

Основной принцип получения химических вакцин – выделение протективных антигенов, обеспечивающих развитие надежного иммунитета, и очистка этих антигенов от балластных веществ. Расщепленные (сплит-вакцины) состоят из частичек разрушенных вирионов.

Методы выделения из бактерий или вирусов протективных антигенов: * осаждением спиртами, высаливанием нейтральными солями; * очистка ультрафильтрацией, хроматографией, центрифугированием.

Преимущества химических вакцин:  низкая реактогенность, что позволяет вводить человеку большие дозы антигена и многократно;  достаточная иммуногенная активность, обеспечивающая развитие надежного иммунитета;  могут применяться в различных ассоциациях, направленных одновременно против ряда инфекций;  устойчивы к факторам внешней среды, хорошо хранятся.

Недостатки химических вакцин:  быстро рассасываются, поэтому для усиления эффективности химических вакцин их используют с адъювантами. В РФ выпускают химические вакцины против гриппа, менингококковой инфекции, холеры, брюшного тифа.

Адъюванты- применяются для усиления иммуногенности вакцинных препаратов. В качестве адъювантов используют минеральные сорбенты, полимеры, сложные химические соединения, бактериальные клетки и их компоненты, липиды и эмульгаторы, вещества, вызывающие воспаление. Все эти вещества обладают одним свойством-способностью усиливать иммуногенность различных антигенов.

Для усиления иммуногенности вакцинных препаратов прибегают к помощи адъювантов (от лат. adjuvant - помощник). В качестве адъювантов используют минеральные сорбенты (гели гидрата окиси и фосфата алюминия), полимеры, сложные химические соединения (ЛПС, мурамилдипептид), бактериальные клетки их компоненты (БЦЖ, коклюшные бактерии), липиды и эмульгаторы (ланолин, арлацел), вещества, вызывающие воспаление (сапонин, скипидар). Все эти различные по природе происхождения и химической структуре вещества имеют одно общее свойство - способность усиливать иммуногенность различных антигенов. Механизм действия адъювантов очень сложный: они действуют не только на антиген, но и на организм. Действие на антиген заключается в укрупнении его молекулы, превращении растворимой формы в корпускулярную. В результате антиген лучше захватывается и представляется иммунокомпетентным клеткам, т.е. превращается из тимусзависимого в тимуснезависимый. Кроме того, адъюванты в месте введения вызывают воспалительную реакцию с образованием фиброзной капсулы, в результате чего антиген долгое время сохраняется (депонируется в месте инъекции и действует длительное время – эффект ревакцинации). В связи с этим адъювантные вакцины еще называют депонированными. Кроме того, адъюванты непосредственно активируют

пролиферацию клеток Т-, В-, А-систем иммунитета и в несколько раз усиливают синтез защитных белков организма. Обычно адъюванты усиливают иммуногенность антигенов в несколько раз, а некоторых антигенов - в десятки раз.

АдЪюванты – вещества разнообразной химической природы, неспецифически стимулирующие иммунный ответ к различным антигенам. В качестве адъювантов используют: гидроксид алюминия, аэросил, минеральные масла, ДЭАЭ-декстран, сапонин, синтезированные вещества (мурамилдипептид, полианионы, поликатионы). Одни Адъюванты вызывают воспалительную реакцию, другие способствуют депонированию антигенов и замедляют их гидролиз, третьи способствуют усилению поглощения макрофагами антигенов.

К ним предъявляют требования: 1. Они должны быть нетоксичными в используемых дозах. 2. Не вызывать побочных реакций в организме. 3. Не обладать антигенной активностью. 4. Должны стимулировать развитие длительного гуморального и клеточного иммунитета.

Механизм действия: Основное свойство большинства адъювантов - способность их депонировать антиген, то есть адсорбировать его на своей поверхности и длительное время сохранять в организме, что увеличивает продолжительность его влияния на иммунную систему.

Наиболее сильные адъюванты содержат в своем составе микроорганизмы ослабленных штаммов или какие-либо субстанции, извлеченные из них. Эти компоненты являются стимуляторами клеток врожденного иммунитета, таких как макрофаги и другие антигенпрезентирующие клетки.

Для направленной доставки антигена в лимфоидные органы используют липидные пузырьки - липосомы. Это позволяет точно дозировать антиген и избежать его влияния на структуры, не вовлеченные в формирование иммунного ответа.

После добавления адъюванта вакцину контролируют на отсутствие посторонних контаминантов (бактерий, грибов) путем посева на питательные среды. Роста микроорганизмов быть не должно. Затем вакцину фасуют во флаконы и этикетируют. Окончательный контроль вакцины на основные показатели: авирулентность, стерильность, безвредность, допустимую степень реактогенности, антигенную и иммуногенную активность осуществляют государственные котроллеры в соответствии с техническими условиями на данный препарат.