7. Как можно разрушить комплемент? Что практически применяется в качестве комплемента? Каким способом обрабатывают комплемент для получения препарата с длительным сроком хранения?

 Для получения одной серии комплемента делается смесь сыворотки от 30-50 свинок. Обработка крови для получения сыворотки производится обычным, описанным выше способом. Консервантом в жидком комплементе является смесь из 4,5 % раствора борной кислоты и сернокислого натрия. Сила комплемента определяется его титром, т.е. наименьшей дозой, способствующей полному гемолизу 1 мл сенсибилизированных бараньих эритроцитов. Для постановки реакций иммунитета (гемолиз, бактериолиз, РСК) берут рабочую дозу комплемента, которая на 20-30 % превышает вытитрованную минимальную дозу, так как в реакциях активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами (антигеном, сывороткой). Комплемент пригоден к отпуску при титре от ОД до 0,25 в разведении 1:10. Он должен быть прозрачным, негемолизированным, обладать способностью адсорбироваться комплексом антиген + антитело и не быть гемотоксичным. Комплемент выпускается в жидком виде со сроком годности в 2 месяца при условии хранения при температуре 3-6 °С и в высушенном состоянии со сроком годности в 3-4 года. Препарат сухого комплемента сохраняется при обычной комнатной температуре.

8. При постановке каких реакций иммунитета (из перечисленных) необходимо добавлять комплемент: реакция нейтрализации токсина антитоксином, реакция преципитации, реакция агглютинации, реакция иммунного бактериолиза, реакция иммунного гемолиза, РСК?

9. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ): принцип реакции; укажите последовательность процессов при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты; что является антигеном, что - антителами, чем помечены антитела; как учитывается результат реакции, с помощью какого микроскопа; как выглядит положительный результат; практическое применение - что можно обнаружить с помощью этой реакции?

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

10.Непрямая реакция иммунофлюоресценции - укажите последовательность событий при этой реакции; преимущество по сравнению с прямой РИФ.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.