Занятие 16 Реакции иммунитета (окончание)

1. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки, контроли, практическое применение.

Реакция гемолиза (РГ) – это разрушение эритроцитов при действии антител при участии комплемента. Компоненты РГ. 1. Антиген - 3% взвесь эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия; 2. Антитело - гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам (гемолизины); сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана; 3. Комплемент – система белков крови, которые адсорбируюся на комплексе антиген-антитело и формируют мембраноатакующий комплекс, который разрушает антиген, т.е. разрушает эритроциты или, по-другому, вызывает лизис эритроцитов (гемолиз). В качестве комплемента используется свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок. Если в пробирку поместить в определенных количествах эритроциты, гемолитическую сыворотку и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет разрушение (гемолиз) эритроцитов, в результате чего смесь из темно-красной станет розовой ("лаковая кровь"). Реакция гемолиза используется в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.

Антитела могут вызывать лизис, т.е. растворение клеток, только при участии комплемента (С). Следовательно, все реакции с участием С называются реакциями иммунного лизиса. К ним относят: РСК, р. гемолиза, р. бактериолиза.

Реакция гемолиза. Реакция гемолиза используется для определения титра и активности комплемента, а также как индикатор для оценки РСК; реакция локального гемолиза в геле носит название реакции Ерне. Реакция Ерне. Используется для определения числа антителообразующих клеток в лимфоидных органах; в гель вносятся эритроциты, суспензия клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент – число образующихся в результате реакции зон гемолиза равно числу клеток, секретирующих гемолизины.

Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, ан­титела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритро­цитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лако­вую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для об­наружения комплемента.

 Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант ре­акции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют ком­племент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, об­разуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.

Гемолиз, как и бактериолиз, происходит при участии специфического антитела и комплемента. Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии гемолитической сыворотки на соответствующие эритроциты в присутствии комплемента получается их растворение (гемолиз), взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость — так называемую лаковую кровь. В отличие от гемолиза эритроцитов, получаемого каким-либо другим путем (например, действием на эритроциты дистиллированной воды, микробного яда и т. д.), действие иммунной гемолитической сыворотки строго специфично, т. е. она вызывает гемолиз только тех эритроцитов, которые были взяты для иммунизации. Реакция гемолиза благодаря своей наглядности получила широкое применение как вспомогательная реакция при постановке серологических диагностических реакций (реакция связывания комплемента Борде — Жангу, реакция Вассермана).

2. Реакция связывания комплемента (РСК): принцип РСК; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства?

Реакция связывания комплемента (РСК) – это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая, 2-ая – гемолитическая система. Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается, поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система. РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний. РСК также используется для сероидентификации.

Компоненты РСК. 1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым). 2. Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации). 3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции. 4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана. 5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная). 6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Постановка РСК. Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56С в течение 30 мин. РСК проводят в 2 фазы. I фаза – специфическая: в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин. II фаза – индикаторная: в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин. Учет результатов РСК проводят при безупречных результатах в контролях. Положительная реакция (человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция (человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь". В диагностике инфекционных заболеваний также используются реакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА). 3. С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает - положительный или отрицательный результат?

4. Методика постановки РСК. Почему исследуемую сыворотку надо инактивировать? Для чего необходимо определение титра и рабочей дозы комплемента? Что произойдёт, если в реакции будет избыток комплемента или недостаточное количество его?

Для инактивации комплемента

Реакция связывания комплемента (РСК) применяется для обнаружения антител в сыворотке крови или для выявления антигена в материале от больного. Эта реакция основана на том, что при взаимодействии антигена с антителом образуется комплекс, который адсорбирует (связывает) комплемент. Однако этот феномен протекает в пробирке без видимых проявлений. Для выявления результатов реакции в качестве индикаторной системы используют реакцию гемолиза. Таким образом, в РСК задействованы две системы: специфическая, в которой определяют возможность образования иммунного комплекса антитело + антиген + комплемент, и индикаторная—гемолитическая система, которая включает эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Проведение реакции делится на две фазы. В первую фазу проводят раздельную инкубацию специфического и индикаторного комплексов. Во вторую фазу смешивают указанные комплексы, что позволяет определить локализацию комплемента по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов. Так, если имеет место соответствие антигена и антитела, происходит связывание этим комплексом комплемента, а реакция гемолиза будет отрицательной, так как в системе отсутствует свободный комплемент. Если же соответствия между антигеном и антителом нет, комплемент свяжется с гемолитической системой, результатом чего будет гемолиз эритроцитов. РСК широко применяется в диагностике инфекционных болезней — сыпного тифа, туберкулеза, сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде— Жангу), протозойных и вирусных инфекциях. Для постановки реакции необходимы: — исследуемая сыворотка, полученная путем венепункции; — антиген; — комплемент; — эритроциты барана; — гемолитическая сыворотка. Подготовка ингредиентов для постановки РСК: 1. Сыворотку крови, полученную от больного путем венепункции, перед исследованием инактивируют прогреванием на водяной бане (в инактиваторе) при 56 °С в течение 30 мин. Перед постановкой реакции сыворотку разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:5 (0,1 мл сыворотки + 0,4 мл изотонического раствора). 2. Антигеном могут быть взвесь целых бактериальных клеток в дистиллированной воде или изотоническом растворе натрия хлорида, убитых нагреванием при 60 °С в течение 1 ч или при 100 °С в течение 15-20 мин, микробные полисахариды и белки, лизаты и экстракты из микробных культур, патологически измененных и нормальных тканей. Предварительно определяют титр антигена для исключения его антикомпле-ментарности и гемотоксичности. Для этого готовят основное разведение антигена, содержащее 1 млрд, микробных тел в 1 мл изотонического раствора натрия хлорида (по оптическому стандарту мутности). В ряд пробирок вносят несколько последовательно уменьшающихся доз основного разведения антигена от 0,5 до 0,05 мл, добавляют до 1 мл изотонический раствор и по 0,5 мл рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37 °С в течение 1 ч. После этого во все пробирки вносят по 1 мл смеси гемолитической системы (гемолитической сыворотки + эритроциты барана). Выдерживают 1 ч в термостате при той же температуре и проводят учет результатов. Титром антигена считают наименьшую дозу, при которой прекращается задержка гемолиза и, следовательно, отсутствует его антикомплементарное действие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составляющую примерно 0,5-0,75 его титра. 3. Комплементом является смесь нативных сывороток, полученных от 3-5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах. Перед постановкой РСК комплемент титруют для определения наименьшего его количества (титр комплемента), которое вызывает гемолиз 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 (0,1 мл комплемента + 0,9 мл изотонического раствора натрия хлорида) и разливают в ряд пробирок в объеме от 0,05 до 0,5 мл. Доводят общий объем в пробирках изотоническим раствором до 1,5 мл и инкубируют в термостате при 37 °С в течение 45 мин. Затем добавляют в каждую пробирку гемолитическую смесь (0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре + 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов барана) в объеме 1 мл. Ставят 2 контроля: — контроль гемолитической системы—1 мл гемолитической смеси + 1,5 мл изотонического раствора; — контроль комплемента—0,5 мл основного разведения комплемента 1:10 + 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов + 1,5 мл изотонического раствора. Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат на 30 мин. Определяют титр комплемента — минимальное количество, при котором еще происходит полный гемолиз эритроцитов. При постановке РСК пользуются рабочей дозой комплемента, которая соответствует титру, увеличенному на 20-30% (это соответствует количеству комплемента в предпоследней пробирке (гемолиз).

Степень интенсивности реакции оценивают по четырехплюсовой системе: ++++ полная задержка гемолиза; жидкость бесцветна, значительный осадок эритроцитов; +++ явная задержка гемолиза; жидкость слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов; ++ частичная задержка гемолиза; жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов; + слабая задержка гемолиза; жидкость интенсивно окрашена, осадок эритроцитов небольшой; ± следы задержки, почти полный гемолиз; осадок в виде облачка; полный гемолиз, «лаковая» кровь, отсутствие осадка. Чувствительность РСК может быть повышена, если ее проводить не при 37 °С, а на холоду (при 4 °С в течение 18 ч).