16. Принцип и метод окраски по Граму в модификации Синёва.

Окрашивание бактерий по Граму – метод окраски, позволяющий разделить данную группу прокариотичеких микроорганизмов на грамотрицательные бактерии и грамположительные бактерии[2].

Грамотрицательные и грамположительные бактерии отличаются строением клеточной стенки. Метод окрашивания бактерий по Граму был предложен в 1884 году датским ученым Х. Грамом[2]. К грамотрицательным бактериям, в частности, относятся кишечные палочки, сальмонеллы, бруцеллы, возбудители дизентерии, холеры, уксуснокислые бактерии, семейство Псевдомонадовые (Pseudomonadaceae).

Основы и сущность метода Метод окрашивания бактерий по Граму основан на различной способности микроорганизмов удерживать в клетке красители трифенилметанового ряда – кристаллический фиолетовый или генциановый фиолетовый. Сущность метода основана на различии в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий[2][1].

Как уже было указано, все бактерии по этому признаку делят на две группы:

грамположительные – красящиеся по Граму; грамотрицательные – не красящиеся по Граму[1].

Техника окрашивания бактерий по Граму Методика поверки бактерий на окрашивание по Граму включает следующие операции: На обезжиренное предметное стекло наносят в трех местах три капли воды и готовят три тонких мазка различных видов бактерий. При этом по краям располагают контрольные мазки с заведомо известным отношением к окраске по Граму. В центре – мазок исследуемой культуры[1].

Мазки высушивают и фиксируют в пламени спиртовки[1].

Мазки окрашивают в течение одной минуты генцианвиолентом. Для этого на предметное стекло кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, и смачивают ее водой[1].

Бумажку с красителем удаляют, на препарат наносят раствор Люголя (водой промывать не надо) и выдерживают 60 секунд, до полного почернения мазка[1].

Не промывая водой, препарат обрабатывают 96% спиртом в течение 15–20 с. При этом предметное стекло покачивают. Важно четко соблюдать указанное время обесцвечивания, поскольку при увеличении его продолжительности наблюдается обесцвечивание и грамположительных бактерий[1].

Препарат промывают водой и накладывают на его поверхность полоску фильтровальной бумаги, пропитанной фуксином Пфейфера, смачивают ее водой и окрашивают в течение 60 секунд[1].

Фильтровальную бумагу с красителем удаляют, препарат промывают водой и осушают чистой фильтровальной бумагой[1].

На препарат наносят кедровое масло и рассматривают с иммерсионным объективом[1].

После такой обработки грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый или синий цвет, а грамотрицательные – в красный[3][1].

17. Отношение бактерий к окраске по Граму. Различия между ними по строению клеточной стенки и по чувствительности к антибактериальным веществам.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамположительные - темно-фиолетового цвета и грамотрицательные - красного. Способность окрашиваться в тот или иной цвет зависит от строения их клеточной стенки и коррелирует со многими другими свойствами бактерий. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, отсутствующая у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта. Фуксин докрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.

Клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий резко различаются по химическому составу и по ультраструктуре.

У грамположительных бактерий клеточная стенка толще (от 20 до80 нм), чем у грамотрицательных, и пептидогликан (синонимы муреин, мукопептид) составляет основную массу ее вещества (от 40 до 90 %). Под электронным микроскопом она выглядит как гомогенный электронно-плотный слой.

Пептидогликан представлен параллельно расположенными молекулами гликана, состоящего из остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидной связью (цв. вклейка,рис. III).

Гликановые молекулы связаны поперечной пептидной связью. Отсюда название этого полимера - пептидогликан. Основу пептидной связи составляют тетрапептиды, состоящие из чередующихся L- и D-аминокислот, например L-аланин - D-глутаминовая кислота - мезодиами-нопимелиновая кислота - D-аланин. В пептидогликане грамположительных бактерий вместо мезодиаминопимелиновой кислоты часто содержится L-диаминопимелиновая кислота или лизин. Элементы гликана (ацетилглю-

козамин и ацетилмурамовая кислота) и аминокислоты тетрапептида (мезодиаминопимелиновая и D-глутаминовая кислоты, D-аланин) являются отличительной особенностью бактерии, поскольку отсутствуют у животных и человека.

В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов и белков.

Входящие в состав клеточной стенки полисахариды, липиды могут ковалентно связываться с ее макромолекулами в отличие от белков, которые формируют на ее внешней поверхности отдельный слой.

Таким образом, основными компонентами клеточной стенки грамположительных бактерий являются три типа макромолекул: пептидогликаны, тейхоевые кислоты и полисахариды, которые, ковалентно связываясь, образуют сложную структуру с весьма упорядоченной пространственной организацией.

Строение клеточной стенки у грамотрицательных бактерий намного сложнее. У них обнаружена многослойная клеточная стенка. В ее состав входит гораздо большее число макромолекул разного химического типа (рис. 4). Пептидогликан образует только внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегая к цитоплазматической мембране. Для разных видов грамотрицательных бактерий его содержание колеблется в широких пределах и существенно меньше ( 5 - 1 0 %), чем у грамположительных бактерий. Химическая структура пептидогликана грамотрицательных бактерий в основном сходна со структурой пептидогликана грамположительных бактерий. Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки - наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липосахарида.

18. Принципы и метод окраски по Цилю-Нильсену.

Кислотоустойчивые бактерии, из-за наличия в их клетках липидов, восков и оксикислот, после окраски их раствором фуксина Циля при нагревании прочно связывают фуксин, прокрашиваются в красный цвет и не обесцвечиваются кислотным раствором спирта. Все остальные окрашенные микроорганизмы обесцвечиваются и дополнительно окрашиваются раствором метиленового

синего в синий цвет.