34. Хламидии, их положение среди микроорганизмов, особенности морфологии, патогенные представители.

Chlamydia trachomatis

Chlamydophila psittaci

Chlamydophila pneumoniae

Из-за своих размеров( первичный 0,3 мм, но может увеличиться до 1 мм) паразиты находятся между бактериями и вирусами, т.к. имеют некоторые признаки как у бактерий( чувствительны к антибиотикам) так и у вирусов( не могут выжить вне клетки). Таким образом, хламидии относятся и к бактериальным и к вирусным микроорганизмам.

Хламидии представляют собой облигатные внутриклеточные паразиты кокковидной формы, размножаются только в цитоплазме клеток позвоночных. Метаболическая активность у них понижена, культивируются при 33—41° С в желточном мешке куриного эмбриона, грамотрицательны, У птиц они вызывают респираторные болезни с генерализацией процесса, у млекопитающих поражают дыха­тельные пути, плаценту, суставы, кишечный тракт

Представители семейства Chlamydiaceae (хламидии) являются патогенными облигатными внутриклеточными бактериями, паразитирующими в чувствительных клетках теплокровных (млекопитающих, птиц, человека и др.)

Они близки по структуре и химическому составу к классическим бактериям. Для них характерно сохранение морфологической сущности на протяжении всего жизненного цикла, деление вегетативных форм, наличие клеточной стенки, содержание ДНК и РНК, энзиматическая активность, чувствительность к антибиотикам широкого спектра, наличие общего родоспецифического антигена.

В то же время хламидии по размерам меньше классических бактерий, имеют небольшой геном, являются облигатными внутриклеточными паразитами с уникальным циклом развития. Они не способны синтезировать высокоэнергетические соединения и обеспечивать собственные энергетические потребности (энергозависимые паразиты), что и определяет их облигатный паразитизм.

С учетом своих особенностей хламидии занимают самостоятельное (особое) положение среди других микроорганизмов — прокариот. Для человека имеют значение преимущественно представители двух родов — Chlamydia и Chlamydophila. Наибольшее значение имеют три вида.

Морфологические особенности.

Клеточный цикл развития хламидий имеет две основных формы — элементарные тельца (ЭТ) — инфекционная форма и ретикулярные тельца (РТ) — вегетативная форма. Сферические ЭТ значительно меньше размерами (менее 300 нм в диаметре), имеют более жестную электронно- плотную структуру, метаболически мало активны, адаптированы к кратковременному внеклеточному существованию.

+Цикл развития хламидий осущесвляется в цитоплазматическом включении — фагосоме (вакуоле), куда ЭТ попадают путем стимулирования эндоцитоза. В процессе адсорбции и эндоцитоза участвуют термолабильные эффекторные белковые поверхностные антигены хламидий. ЭТ подавляют фагосомо — лизосомальное слияние и преобразуются при участии главного поверхностного протеина в РТ, которые обладают активным метаболизмом, более крупными размерами и активным бинарным делением. Цикл размножения заканчивается обратным переходом РТ в ЭТ, разрывом мембран включения и ограничивающих мембран клетки хозяина, выходом ЭТ из клеток, далее ЭТ инфицируют новые клетки. Тельца включений выявляются в клетках при помощи световой и иммунолюминесцентной микроскопии.

Кроме того, хламидии способны образовывать L — формы, персистентные формы

Окраска по Граму. Сущность метода

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму (этапы окраски по Граму представлены на стенде).

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Препарат промывают водой.

5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Окраска по Цилю-Нильсену

Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов, воска и оксикислот. Принцип основан на том, что кислотоустойчивые бактерии за счет содержания указанных веществ прочно связывают карболовый фуксин при нагревании (т.е. окрашиваются в красный цвет) и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются серной кислотой и при использовании дополнительного красителя - метиленового синего – окрашиваются в синий свет.

Методика окраски по Цилю-Нильсену:

1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течение 3-5 мин.

2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

3. Нанести 5 % раствор серной кислоты на 1-2 мин до обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.

Окраска по Ожешко

Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым фуксином. Споры кислотоустойчивы, поэтому красятся в красный цвет.

Методика окраски по Ожешко:

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислотой и подогреть на пламени в течение 2-3 мин.

2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Методика окраски по Романовскому-Гимзе:

Краска Романовского-Гимзе состоит из метиленового синего, эозина и азура.

3. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) на 10-20 мин.

4. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

+Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии - в фиолетовый цвет, лептоспиры - в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в синий цвет. Морфологию спирохет изучают также в живом состоянии в фазово-контрастном или темнопольном микроскопе. Хорошим методом выявления спирохет является серебрение по Морозову.

Окраска по Романовскому-Гимзе. Фиксированный мазок кладут в чашку Петри мазком вниз на подставки из стеклянной соломки или спичек и наливают рабочий раствор краски Романовского-Гимза (15—20 капель на 10 мл воды). Через 15—20 мин препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Бактерии окрашиваются в тёмно-синий цвет, капсулы — в розовый.

Окраска по Михину. На фиксированный мазок наливают метиленовую синь Леффлера (30 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой сини растворяют в 100 мл воды, добавляют 1 мл 1 % раствора NaOH и выдерживают в термостате месяц) при лёгком нагревании выдерживают 3—5 мин, быстро промывают водой и высушивают. Бактерии окрашиваются в синий цвет, капсулы — в розовый.

Метод Бурри-Гинса используется для окраски капсульных бактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бури. Для этого черную тушь смешивают в культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5-10 секунд. В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов.