Выявление и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae.

Образец испытуемого лекарственного препарата в количестве 10 мл вносят в 100 мл лактозного бульона, перемешивают и инкубируют при 30-35°С в течение 2-5 часов. Затем из этой смеси 10 мл переносят в 100 мл среды обогащения. Оставшуюся смесь в лактозном бульоне оставляют в холодильнике. Посев в среде обогащения инкубируют при 30-35°С в течение 18-24 часов. При отсутствии роста считают, что в препарате не содержатся бактерии семейства Enterobacteriaceae.

При наличии роста исследование продолжают. Определяют следующие показатели:

а) наличие Escherichia coli

б) наличие видов Salmonella

в) количество энтеробактерий (кроме Salmonella и Escherichia coli)

Испытание на виды Salmonella проводят путём высевания из среды обогащения на чашки с висмут - сульфит агаром. На этой среде Salmonella образуют чёрные колонии с металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в чёрный цвет. Подозрительные колонии микроскопируют, отсевают на среду Олькеницкого (трёхсахарный агар с солями железа) и ставят тест на цитохромоксидазу.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано (заражено) бактериями рода Salmonella.

Испытание на Escherichia coli проводят путём высева из среды обогащения на чашку со средой Эндо. Подозрительные колонии красного цвета микроскопируют и при наличии грамотрицательных палочек делают пересев в пробирке с цитратным агаром Симмонса, на котором определяют утилизацию цитрата натрия по изменению цвета среды с зелёного на синий. Наличие индола определяют путём посева в питательный бульон.

Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидазой, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано Escherichia coli.

Количественное определение энтеробактерий (кроме Salmonella и Escherichia coli. Смесь в лактозном бульоне (из холодильника) в объёме 10 мл, 1 и 0,1 мл (что соответствует 1,0 и 0,1 г и 0,01 г препарата)) засевают в среду обогащения, инкубируют при 30-35°С в течение 18-24 ч. В случае роста делают пересев на чашку со средой Эндо и по появлению типичных колоний грамотрицательных бактерий устанавливают наличие энтеробактерий в определённом объёме препарата.

Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.

Образец в количестве 10 мл вносят в 100 мл среды обогащения, перемешивают и инкубируют при 30-35°С в течение 24-48 часов. При наличии роста пересеивают на чашку со средой для выявления пиоцианина и на чашку среды с маннитом. После инкубации в термостате отбирают подозрительные колонии.

Идентифицируют Pseudomonas aeruginosa по морфологии (грамотрицательные неспорообразующие палочки), по специфическому запаху и сине - зелёному пигменту, наличию фермента цитохромоксидазы.

Staphylococcus aureus идентифицируют по морфологии (грамположительные кокки), по сбраживанию маннита в анаэробных условиях, по реакции плазмокоагуляции.

58.Возбудитель чумы: название по-латыни, морфология, отношение к окраске по Граму, питательные среды для культивирования, характер роста, источники инфекции, механизмы и пути передачи, клинические формы заболевания, материалы для исследования и методы лабораторной диагностики, лечебные и профилактические препараты.

Таксономия.

Семейство – Enterobacteriaceae

Триба – Yersiniae

Род – Yersinia

Вид – Yersinia pestis

Морфология.

Палочка овоидной формы, вздутая по середине (формой напоминает «бочонок» Грамотрицательные, окрашиваются биполярно (биполярность особенно хорошо выражена при окраске метиленовым синим или по Романовскому-Гимзе). В мазках из патологического материала располагаются цепочками, из бульонных культур – беспорядочно. Образуют нежную капсулу. Спор и жгутиков не имеют.

Культуральные свойства.

Факультативные анаэробы. Оптимальная температура роста – 28-30С, рН – 6,9-7,2. Хорошо растут на простых питательных средах (МПА, МПБ). На поверхности жидкой питательной образуется пленка со спускающимися вниз нитями («сталактитовый рост»). На плотных питательных средах выделяют три стадии роста колоний Yersinia pestis:

- Молодые колонии – обнаруживаются через 8-12 часов культивирования: прозрачные микроколонии с неровными краями, напоминающие «битое стекло»;

- Позднее (через 18-24 часа) – колонии сливаются и появляются нежные плоские образования со светлым зернистым центром и фестончатыми краями в виде «кружевных платочков»;

-Зрелые колонии – образуются через 48-72 часа: крупные колонии с бурым зернистым центром и неровными краями в виде «ромашек».

Биохимическая активность.

Возбудитель расщепляет многие сахара (глюкозу, галактозу, мальтозу, маннит и многие другие) до кислоты без газа. По отношению к глицерину различают 2 варианта возбудителей: глицерин-позитивный (континентальный – с суши) и глицерин-негативный (океанический – с моря). Не ферментирует лактозу, сахарозу и рамнозу. Реакция Фогес-Поскауэра – отрицательная. Протеолитическая активность отсутствует (желатин не разжижает, не восстанавливает нитраты, индол, сероводород и аммиак не образует, молоко не свертывает).

Антигенная структура.

Yersinia pestis содержит до 18 антигенов, но не все они хорошо изучены. Выделяют антигены клеточной стенки:

1. О-антиген – соматический антиген, термостабильный липополисахарид, является эндотоксином.

2. ОСА – основной соматический антиген, белковой природы, является экзотоксином, обладающим гемолитическими свойствами, токсичен для человека и животных (белых крыс и мышей).

Капсульные антигены:

1. F1-антиген (фракция-1) – термолабильный гликопептид, не обладает токсическими свойствами, но защищает возбудителей чумы от фагоцитоза и обуславливает иммуногенные свойства.

2. VW – антиген вирулентности, это фактически два антигена, но они всегда встречаются вместе: V-антиген – белок, а W-фракция – липопротеин. VW обладает антифагоцитарным действием и способствует внутриклеточному размножению возбудителя чумы.

Внутри клетки (в ЦПМ) располагается Т-антиген – «мышиный» токсин (очень ядовит для мышей), белковой природы, блокирует функции митохондрий печени.