Литусов Н.В. Общая микробиология

391

Таким образом, антибиотики, проникнув в микробную клетку, вызывают в ней нарушение метаболических процессов разного уровня и разной продолжительности. Каждая группа антибиотиков или даже отдельные антибиотики одной группы обладают специфичностью действия на отдельные звенья метаболических реакций. Сочетание нескольких антибиотиков, вызывающих нарушения разных метаболических процессов в микробной клетке, приводит к повышению эффективности схем лечения.

13.3. Продуценты антибиотиков

Природные антибиотики обнаруживаются в основном среди метаболитов почвенных микроорганизмов, синтезирующих их в качестве средств выживания в условиях микробного окружения. Животные и растительные клетки также могут вырабатывать антибиотикоподобные вещества, обладающие антимикробной активностью, но широкого распространения в лечебной практике такие соединения не нашли.

По происхождению (продуценту) антибиотики подразделяются на 3 группы:

1. Антибиотики, образуемые грибами и лишайниками. Так, из культуральной жидкости Penicillium notatum первоначально был выделен

пенициллин (рисунок 13.13), Cephalosporium acremonium - цефалоспорин, Aspergillus fumigatus - фумигаллин, Penicillium urticae - гризеофульвин,

Trichothecium roseum - трихотецин. Лишайники продуцируют усниновую кислоту, обладающую сильным антибиотическим действием. К натриевой соли усниновой кислоты особенно чувствительны дифтерийные палочки.

392

а б

Рисунок 13.13 – Penicillium crustosum (а) и Penicillium notatum (б), продуценты пенициллина.

2. Антибиотики, образуемые актиномицетами. Актиномицеты, особенно представители рода стрептомицетов (рисунок 13.14), продуцируют большое количество антибиотиков: Streptomyces greseus - стрептомицин, Str. fradiae - неомицин, Str. canamyceticus - канамицин, Micromonospora purpurea - гентамицин, Str. aureofaciens - хлортетрациклин, Str. venezuelae - хлорамфеникол, Str. erythreus - эритромицин, Str. fradiae - тилозин, Str. bevoris - леворин, Str. spheroides - новобиоцин, Str. mediterranei - рифамицин, Str. neursei -

нистатин. Многие из этих антибиотиков обладают широким спектром действия.

Рисунок 13.14 – Стрептомицеты, окраска по Граму.

3. Антибиотики, выделенные из бактерий. Группа антибиотиков бактериального происхождения менее обширна и имеет меньшее практическое значение, так как их эффективность значительно ниже, чем у антибиотиков, синтезируемых грибами или актиномицетами. Бактерии-продуценты антибиотиков синтезируют грамицидин, колицин, пиоцианин, субтилин, полимиксин и другие антимикробные вещества (рисунок 13.15).

393

а б

Рисунок 13.15 – Бактерии – продуценты антибиотиков: а - Bacillus brevis; б –

Escherichia coli.

Грамицидин выделен в 1939 г. Р.Ж. Дюбо из почвенного микроба В. brevis. В нашей стране грамицидин С получен в 1942 г. Г.Ф. Гаузе и М.Г. Бражниковой. По химическому строению он представляет собой циклический пептид, в который входит пять аминокислот. В 1956 г. осуществлен синтез этого антибиотика.

Колицин - антибактериальный белок, продуцируемый некоторыми штаммами кишечной палочки и подавляющий жизнеспособность других штаммов

Escherichia coli.

Пиоцианин – антибиотическое вещество, получаемое из бактерий вида Pseudomonas aeruginosa. Он активен против большинства грамположительных бактерий.

Субтилин – продукт метаболизма сенной палочки (В. subtilis). Всего из разных штаммов сенной палочки выделено более 70 антибиотиков. Субтилин малотоксичен. Хорошо сохраняется в водных растворах.

Полимиксины - это группа соединений, обладающих узким спектром активности против грамотрицательных микроорганизмов. По химической структуре они представляют собой полипептидные соединения. В обычных дозах обладают бактериостатическим действием, а в высоких концентрациях - бактерицидным действием.

13.4. Принципы получения антибиотиков

Существуют 3 основных способа получения антибиотиков:

-биологический синтез (культивирование продуцентов в оптимальных условиях в жидкой питательной среде с последующей очисткой);

-биосинтез с последующей химической модификацией (получение полусинтетических антибиотиков);

-химический синтез препаратов без участия микроба-продуцента.

Биологический синтез антибиотиков – это технологический процесс

выращивания микроба-продуцента в аппаратах-культиваторах при оптимальных температурных условиях в течение определенного времени в специальной жидкой питательной среде, выделение целевого продукта и его очистка от балластных примесей.

Этапы технологического процесса:

1. Выделение из внешней среды или селекция микроорганизмов - активных

394

продуцентов антибиотиков. Для выделения высоко продуктивных штаммов применяют мутагенез, конструирование суперпродуцентов методами генетической инженерии.

2.Приготовление питательной среды для глубинного выращивания конкретного продуцента антибиотика.

3.Культивирование продуцента глубинным способом с аэрацией или без аэрации с использованием специально разработанных питательных сред в аппаратах-культиваторах (рисунок 13.16). При необходимости (особенно в случае образования микроорганизмом нескольких антибиотиков) обменные процессы направляют в сторону биосинтеза одного определенного антибиотика, изменяя условия культивирования (состава питательной среды, кислотности среды и других параметров).

Рисунок 13.16 – Аппараты (ферментеры) для культивирования продуцентов глубинным способом.

4.Выделение и очистка антибиотиков из культуральной жидкости методами осаждения или кристаллизации из водной среды, экстракции, сорбции на ионнообменных материалах, перекристаллизации. После ферментации и выделения антибиотиков из культуральной жидкости они подвергаются очистке от балластных примесей.

5.Высушивание готового продукта с помощью лиофилизации или распылительной сушки. Стандартизация готового препарата по содержанию антибиотика.

6.При производстве пероральных препаратов осуществляется таблетирование с последующей расфасовкой в емкостную тару или путем запрессовывания в упаковочный материал.

7.При производстве антибиотиков в жидком виде для парентерального применения производится фасовка препарата в асептических условиях в ампулы или флаконы. При необходимости производится высушивание препарата в сублимационных установках.

8.Этикетирование готового продукта.

Биосинтез с последующей химической модификацией используется при получении полусинтетических антибиотиков. У полусинтетических препаратов сохраняется основное ядро исходной молекулы антибиотика, а некоторые радикалы удаляются или заменяются. Особенно большие успехи были достигнуты в

395

получении полусинтетических пенициллинов. Ядром молекулы пенициллина является 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК), состоящая из β-лактамного и тиозолидинового колец. 6-АПК обладает низкой антибактериальной активностью. При присоединении к молекуле 6-АПК бензильной группы получают бензилпенициллин, который отличается высокой антимикробной активностью. Замена бензильного остатка в молекуле бензилпенициллина на другие органические соединения позволила получить такие антибиотики как метициллин, оксациллин, ампициллин.

Химический синтез антибиотиков предусматривает создание препаратов синтетическим путем без использования природных предшественников. В частности, фторхинолоны были синтезированы на основе налидиксовой кислоты (производное нафтиридина) и оксолиниевой кислоты (производное хинолона). Фторхинолоны дополнительно содержали атом фтора и пиперазиновое кольцо. В результате этого фторхинолоны обладают выраженной противомикробной активностью и широким спектром действия.

Перспективные биотехнологические разработки получения антибиотиков:

-методы иммобилизации антибиотиков;

-модификация молекул естественных антибиотиков химическими методами;

-применение генно-модифицированных продуцентов антибиотиков.

Причины поиска и разработки новых антибиотиков:

-малая чувствительность некоторых патогенных микроорганизмов к применяемым антибиотикам;

-формирование резистентных форм микроорганизмов при длительном применении антибиотиков;

-расширение сферы применения антибиотиков.

13.5. Требования, предъявляемые к антимикробным препаратам

К антимикробным препаратам предъявляются определенные требования:

1. Отсутствие токсического действия на организм человека (безвредность препарата). Безвредность устанавливается с помощью химиотерапевтического индекса - отношения максимально переносимой дозы к минимальной терапевтической дозе или минимальной терапевтической дозы к максимально переносимой дозе. При индексе соответственно больше 3 или меньше 1 препарат может быть использован для лечения инфекционного заболевания, поскольку его терапевтическая доза будет меньше переносимой дозы. Величина химиотерапевтического индекса может быть определена по формуле:

Т = МИК/К,

где Т – терапевтический индекс; МИК – минимальная ингибирующая концентрация (мкг/мл); К - концентрация антибиотика (мкг/мл) в очаге инфекции (или в крови) при введении терапевтических доз препарата (таблица 13.4).

396

Таблица 13.4 – Концентрация антибиотиков в крови (К) после введения среднетерапевтических доз препарата

2.Выраженное избирательное действие на микроорганизмы, определяемое антимикробным спектром - преимущественным действием на те или иные бактерии (грамположительные или грамотрицательные).

3.Бактериостатическое или бактерицидное действие

(микробостатическое или микробоцидное действие) - полное или частичное подавление роста и размножения бактерий или их гибель.

4.Отсутствие у бактерий способности к формированию лекарственно-

устойчивых форм.

Критерии активности антибактериального препарата:

- минимальная ингибирующая концентрация (МИК) - наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост тест-культуры микробов;

- минимальная бактерицидная концентрация (МБК) - наименьшая концентрация препарата, вызывающая бактерицидный эффект.

При клиническом использовании антибиотики дозируются из расчета на 1 кг веса или на всю массу тела человека. В обоих случаях дозы варьируют в зависимости от пути введения, возраста и состояния больного, тяжести болезни, состояния органов выделения, степени чувствительности бактерий к антибиотику и свойств препарата. Например, при введении препарата через рот доза его в 2-4 раза больше, чем при внутримышечном ведении; при сепсисе вводят максимальное количество препарата и по возможности внутривенно; ослабленным больным вводят половину обычной дозы.

Различают следующие дозы антибиотиков:

- лечебная доза - доза, оказывающая выраженный терапевтический эффект

397

при определенном способе введения;

-профилактическая доза - доза, оказывающая профилактический эффект при принятом способе введения препарата;

-стимулирующая доза - доза антибиотика, оказывающая стимулирующий эффект при введении с другими препаратами;

-токсическая доза - доза препарата, оказывающая токсический эффект при принятом способе введения;

-смертельная (летальная) доза - доза антибиотика, вызывающая летальный эффект при однократном введении в организм.

Изучением процессов поступления антибиотиков в организм и распределения его в тканях организма занимается фармакокинетика и фармакодинамика. Под фармакокинетикой понимают процесс изменения концентрации препарата в организме в течение времени. Фармакокинетика изучает такие вопросы как всасывание препарата, распределение его по органам и тканям (тканевая диффузия), метаболизм антибиотика (расщепление препарата в организме) и его экскреция. С учетом фармакокинетики определяют интервал между введениями антибиотика и способ его введения. Терапевтически эффективным считается уровень препарата, который в течение длительного времени при минимальной концентрации оказывает тормозящий эффект на возбудителя.

Под фармакодинамикой понимают специфическое действие препарата на макроорганизм и возбудитель, находящийся в организме. Фармакодинамика изучает также механизмы действия антибиотика, выявляет связь между концентрацией препарата и достигнутым эффектом. Антибиотик лишь воздействует на возбудителя заболевания - окончательная ликвидация инфекционного процесса происходит в результате мобилизации защитных механизмов макроорганизма.

Прежде чем назначать тот или иной антибиотик, необходимо знать его свойства, способ введения, спектр и механизм противомикробного действия, срок сохранения в организме и пути выведения из организма, а также показания к применению. Нельзя использовать антибиотикотерапию в течение длительного времени, так как продолжительный прием антибиотиков приводит к угнетению нормальной микрофлоры организма. Одновременно с этим размножается нечувствительная к антибиотику микрофлора, обусловливающая дисбактериозы, сопровождающиеся гастроэнтеритом, колитом, кандидозом и другими заболеваниями.

Выбор антибиотиков обязательно должен проводиться по фармакологическим критериям (в зависимости от концентрации в очаге инфекции). Так, высокую концентрацию в моче создают пенициллин, ампициллин, аминогликозиды, тетрациклины; в костной ткани – аминогликозиды, маролиды, линкомицин, тетрациклины; в желчи – ампициллин, тетрациклины, макролиды, левомицетин; в легочной ткани – тетрациклины, макролиды; проходящие через гемато-энцефалический барьер – пенициллины, ампициллин.

13.6. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

При использовании антибиотиков выраженный лечебный эффект достигается

398

в случае применения тех препаратов, к которым возбудитель наиболее чувствителен. Определение чувствительности возбудителя к антибиотикам проводится перед началом лечения и периодически – в ходе лечения. В настоящее время на практике используются следующие методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

1. Метод серийных разведений в жидких средах. В жидкие среды с серийными разведениями антибиотиков вносят исследуемую культуру, инкубируют посевы 10-18 часов при 37°С, и учитывают результаты визуально или нефелометрически. Иногда в среду добавляют глюкозу и индикатор, что позволяет учитывать результаты по изменению окраски среды. Этот метод позволяет установить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) или минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата для конкретного возбудителя. Исследование можно выполнять в различных объемах питательной среды - от 1 до 10 мл; в качестве питательной среды обычно используют МПБ или любую другую среду, соответствующую питательным потребностям возбудителя. В пробирках с питательной средой готовят серию двойных разведений антимикробного препарата. В качестве контроля используют пробирку с питательной средой без антибиотика. В каждую пробирку (с антибиотиком и контрольную) вносят суспензию бактерий с концентрацией 106 микробных клеток/мл. Пробирки инкубируют 10-18 часов при 37°С (или до появления бактериального роста в контрольной пробирке). По истечении указанного срока учитывают результаты. МПК соответствует наибольшему разведению препарата, тормозящему рост тест-культуры (рисунок

13.17).

Концентрация антибиотика, мкг/мл

0 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32

Рисунок 13.17 – Определение МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

2.Метод серийных разведений в плотных средах. Метод аналогичен предыдущей процедуре, но проводится на плотных питательных средах. При использовании этого метода готовят серийные разведения антимикробного препарата, затем вносят каждое разведение в пробирки, содержащие охлажденную агаровую среду. Содержимое пробирки после перемешивания быстро переносят в чашки Петри либо пробирки “скашивают” до застывания агара. Затем агар засевают исследуемой культурой (петлей или специальным дозатором). Посевы инкубируют 18-20 часов при 37°С. После инкубирования посевов определяют МИК по отсутствию роста на чашках или в пробирках, содержащих наименьшие концентрации препарата.

3.Диффузионные методы. Эти методы менее чувствительны, чем методы

399

стандартных разведений, но проще по выполнению. На практике их применяют чаще. Эти методы позволяют определять чувствительность бактерий к нескольким антибиотикам одновременно.

Классический метод. В чашки Петри вносят тонкий слой (4-5 мм) плотной питательной среды. После застывания на поверхность агара наносят микробную взвесь (105 клеток/мл) и равномерно распределяют по поверхности агара. Излишки суспензии удаляют, а чашки подсушивают в термостате. Затем в агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемого антибиотика, после чего чашки помещают в термостат. После инкубирования в оптимальных условиях измеряют диаметр зоны подавления роста вокруг лунки для каждого препарата (рисунок 13.18).

Рисунок 13.18 – Результат классического диффузионного метода определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Метод дисков (диско-диффузионный метод). Для определения чувствительности бактерий с помощью этого метода на агар высевают исследуемую культуру (суспензия, содержащая 109 клеток/мл). После этого на поверхность агара промещают диски из фильтровальной бумаги, пропитанные антибиотиками. Для этого используют коммерческие диски, содержащие определенные концентрации антибиотиков (рисунок 13.19).

а б Рисунок 13.19 – Диски с антибиотиками (а) и диспенсеры (аппликаторы) для

одновременного нанесения 6-12 дисков (б).

Посевы инкубируют при 37°С в течение времени, необходимого для роста конкретного возбудителя. Вокруг дисков в зависимости от активности и концентрации антибиотика образуются разной величины зоны задержки роста исследуемого микроба (рисунок 13.20).

Результат

400

4

Рисунок 13.20 – Результаты диско-диффузионного метода определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

За рубежом выпускаются гексадиски (6 объединенных дисков) и октодиски (8 объединенных дисков), позволяющие определять чувствительность бактерий одновременно к 6 или 8 антибиотикам (рисунок 13.21).

Рисунок 13.21 - Гексадиски и октодиски для определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Зоны задержки роста культур измеряют с помощью линейки. Полученные размеры зон сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкции, после чего микроорганизмы относят к той или иной группе (чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным). Показатели активности основных антибиотиков, определяемые методом стандартных индикаторных дисков, представлены в таблице 13.5.

Таблица 13.5 – Показатели активности основных антибиотиков, определенные методом стандартных индикаторных дисков