Литусов Н.В. Общая микробиология

301

Рисунок 10.34 – Результат введения мышам убитых капсульных клеток.

Однако смесь убитых капсульных клеток и живых бескапсульных пневмококков вызывает гибель мышей. В этом случае из органов павших животных на питательном агаре высеваются капсульные пневмококки, образующие колонии S- формы (рисунок 10.35).

Рисунок 10.35 – Результат введения мышам смеси убитых капсульных и живых бескапсульных пневмококков.

Следовательно, в организме мышей (in vivo) происходит превращение (трансформация) бескапсульных клеток в капсульные клетки под воздействием какого-то фактора из убитых капсульных пневмококков. Длительное время механизм этого явления оставался неизвестным. Только в 1944 г. американские биологи О. Эвери, К. Маклауд и М. Маккарти установили причину превращения бескапсульных пневмококков в капсульные клетки. Для установления природы трансформирующего агента они выделили из убитой культуры капсульного пневмококка отдельные фракции белков, полисахаридов, РНК и ДНК. Каждую фракцию они смешивали с живой культурой бескапсульного пневмококка и вводили

ворганизм белых мышей, отчасти повторив опыт Ф. Гриффита (рисунок 10.36):

-введение живых бескапсульных пневмококков не вызывает гибели лабораторных животных (1);

-введение живых капсульных пневмококков приводит к гибели лабораторных животных (2);

-введение ДНК капсульных клеток не вызывает гибели животных (3);

-введение смеси живых бескапсульных клеток и ДНК капсульных клеток приводит к гибели мышей (4).

302

1 2 3 4

Рисунок 10.36 – Эксперимент О. Эвери, К. Маклауда и М. Маккарти (пояснения в тексте).

Этим экспериментом они установили, что изменение признаков происходит в результате поглощения бескапсульными клетками в организме животных ДНК капсульных клеток. Дальнейшее изучение этого явления показало, что к поглощению ДНК способны не все клетки, а только те, которые находятся в определенном физиологическом состоянии (состоянии компетентности). Состояние компетентности вызывает специальный низкомолекулярный белок (фактор компетентности), который бактерии синтезируют при определенных условиях выращивания. Максимальное число компетентных клеток наблюдается в конце стадии логарифмического роста бактерий. Фактор компетентности способствует синтезу аутолизина, эндонуклеазы и ДНК-связывающего белка, которые обусловливают проникновение нуклеиновой кислоты в реципиентную клетку. Трансформирующая ДНК адсорбируется на ДНК-связывающем белке, затем проникает внутрь клетки и встраивается в гомологичный участок хромосомы реципиента.

В трансформации может участвовать как хромосомная, так и плазмидная ДНК. Хромосомные гены после проникновения в реципиентную клетку встраиваются в хромосому бактерии, а плазмидные гены либо интегрируют в хромосому реципиента, либо сохраняются в автономном состоянии (рисунок 10.37).

При трансформации реципиенту могут быть перенесены различные признаки (например, синтез ферментов и капсульного полисахарида, устойчивость к антибиотикам). Феномен трансформации воспроизводится в опытах с разными патогенными и непатогенными бактериями: бациллами, стрептококками, менингококками и др. Наиболее эффективно трансформация протекает у близкородственных бактерий.

303

Трансформант

Стабильный Нестабильный трансформант трансформант

Рисунок 10.37 – Трансформация бактерий посредством хромосомной и плазмидной ДНК.

В 1946 г. американские генетики и биохимики Д. Ледерберг и Э. Тейтем (рисунок 10.38) описали другой способ переноса генетического материала от одной бактерии в другую - конъюгацию (лат. conjugatio - соединение).

А Б

Рисунок 10.38 - А - Джошуа Ледерберг (Joshua Lederberg, 1925-2008 гг.), Б - Эдвард Тейтем (Edward Lawrie Tatum, 1909-1975 гг.).

Конъюгация - это передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент при их непосредственном контакте через конъюгационный мостик. Способность одной бактериальной клетки конъюгировать с другой связана с наличием F-плазмиды (англ. fertility - плодовитость). Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, не способны быть донорами, они обозначаются как F¯- клетки (женские клетки). Клетки, имеющие F-фактор, обозначаются как F+-клетки (мужские клетки). Перенос информации происходит в одном направлении: от F+- клетки к F¯-клетке. Конъюгационный мостик образуют половые ворсинки - sexпили (рисунок 10.39).

304

Рисунок 10.39 – Конъюгационный мостик.

При контакте F+-клетки передают реципиенту F-плазмиду в виде цельной структуры, при этом F‾-клетки превращаются в F+-клетки и становятся способными к дальнейшей конъюгации. При наличии в клетках-донорах Hfr-плазмид при конъюгации происходит передача в клетку-реципиент фрагмента бактериальной хромосомы.

Механизм конъюгации состоит в том, что F-плазмида кодирует эндонуклеазу, разрезающую одну из нитей плазмидной ДНК в определенной точке. Затем разрезанная цепь раскручивается и 5'-концом продвигается в клеткуреципиент. В самом начале поступающей в реципиентную клетку нити плазмидной ДНК расположены антирестрикционные гены, которые детерминируют синтез белков, препятствующих разрушению ДНК клеточными ферментами реципиента. В реципиентной клетке на основе поступившей нити ДНК восстанавливается двунитевая структура плазмиды. Оставшаяся в клетке донора нить ДНК является матрицей для синтеза второй нити. Весь процесс длится несколько минут (рисунок

10.40).

Рисунок 10.40 – Процесс конъюгации.

Перенос с помощью F-плазмид хромосомных генов возможно только в случае интеграции плазмиды в бактериальную хромосому (Hfr+-клетки). В этом случае перенос ДНК начинается с разрыва одной из нитей ДНК в месте включения F-фактора. Затем одна цепь ДНК переносится в реципиентную клетку, а другая цепь остается в клетке-доноре. При таком переносе с высокой частотой передаются хромосомные гены, расположенные вблизи начала переноса. После переноса в

305

клетке-реципиенте происходит гомологичная рекомбинация между привнесенной донорской ДНК и собственной ДНК реципиента.

В 1952 г. Джошуа Ледерберг и Нортон Циндер в опытах на сальмонеллах открыли еще один вид генетического обмена – трансдукцию. Трансдукция - это процесс передачи ДНК от клетки-донора в клетку-реципиент при участии бактериофагов. Трансдуцирующими свойствами обладают только умеренные фаги. Размножаясь в клетке-доноре, фаги включают в состав своего генома часть бактериальной ДНК. В дальнейшем, проникая в реципиентную клетку, они передают ей ДНК донора. Образующийся в результате трансдукции рекомбинант называется трансдуктантом (рисунок 10.41).

Хромосома

Фаг

Рисунок 10.41 – Процесс трансдукции.

Различают 3 типа трансдукции:

-неспецифическая (общая) трансдукция;

-специфическая трансдукция;

-абортивная трансдукция.

Неспецифическая трансдукция – это процесс, при котором ДНК фага встраивается в различные участки хромосомы бактерии и переносит случайные гены. При этом фаг выступает в качестве “пассивного” переносчика генетического материала бактерий. При неспецифической трансдукции в реципиентные клетки могут быть перенесены гены, определяющие синтез ферментов, аминокислот, пуринов, пиримидинов, гены резистентности к антибиотикам и др. При неспецифической трансдукции фаг может утратить часть своего генома и стать дефектным. Привнесенный фагом фрагмент ДНК клетки-донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки-реципиента.

Специфическая трансдукция – это процесс, при котором бактериофаг встраивается в строго определенный участок генома бактерии и переносит только определенные гены. Например, ДНК умеренного бактериофага λ кишечной палочки всегда встраивается между генами gal и bio. При активации такой фаг захватывает только рядом расположенную строго определенную область хромосомы и передает ее реципиентной клетке - либо ген gal, либо ген bio (рисунок 10.42).

306

Рисунок 10.42 – Схема специфической трансдукции.

Абортивная трансдукция – это перенос фагом из одной клетки в другую участка ДНК, который не включается в геном реципиента. При таком переносе проявления нового признака не наблюдается. При абортивной трансдукции привнесенный фрагмент ДНК передается только одной из двух дочерних клеток (рисунок 10.43).

Рисунок 10.43 – Схема абортивной трансдукции.

При трансдукции возможен перенос генов, контролирующих питательные потребности бактерий, их устойчивость к лекарственным препаратам, подвижность и другие свойства. Приобретение бактериями новых свойств с помощью трансдуцирующих фагов называется лизогенией.

В 1958 г. Д. Ледерберг, Дж. Бидл и Э. Тейтем были удостоены Нобелевской премии за фундаментальные исследования организации генетического материала у бактерий.

10.3. Понятие о генной инженерии

Микроорганизмы широко используются в производстве антибиотиков, аминокислот, ферментов и других соединений. В качестве продуцентов применяют бактерии, селекционированные по уровню синтеза целевых продуктов. Для селекции продуцентов применяют как традиционные методы (отбор по продуктивности, искусственный мутагенез), так и генную инженерию.

Генная (генетическая) инженерия - это раздел молекулярной биологии, исследующий возможность создания лабораторным путем новых генетических

308

В 1973 г. английский биохимик Ф. Сенгер (рисунок 10.46) показал, что после ферментативного расщепления молекулы ДНК возможно реконструировать ее двухцепочечную структуру по шаблону одинарной цепи. Этот метод позволяет устанавливать нуклеотидную последовательность ДНК.

Рисунок 10.46 – Фредерик Сенгер (Frederick Sanger, родился в 1918 г.).

В 1977 г. американские ученые У. Гилберт (рисунок 10.47) и А. Мексем разработали процедуру установления нуклеотидной последовательности ДНК – метод секвенирования.

Рисунок 10.47 – Уолтер Гилберт (Walter Gilbert, родился в 1932 г.).

В1980 г. Ф. Сенгер, У. Гилберт и П. Берг были удостоены Нобелевской премии за фундаментальные исследования нуклеиновых кислот.

В1973 г. американские ученые С. Коэн и Г. Бойер (рисунок 10.48) в плазмиду одной бактерии встроили фрагмент плазмиды другой бактерии и показали возможность функционирования химерной (искусственно созданной) молекулы ДНК в клетках E. coli.

С тех пор генетически измененные (модифицированные) организмы получают либо путем введения нужного гена из генома одного организма в геном другого организма, либо путем встраивания в геном бактерии искусственно синтезированного гена. С помощью методов генетической инженерии возможно увеличить количество вырабатываемого микроорганизмами необходимого продукта (аминокислот, ферментов, полисахаридов); осуществлять перенос генов млекопитающих в клетки микроорганизмов (бактерии, дрожжи) для получения

309

гормонов, интерферонов, ферментов, иммуноглобулинов; генетически изменять соматические клетки человека, страдающего наследственными заболеваниями.

А Б

Рисунок 10.48 – А - Стэнли Коэн (Stanley Cohen, родился в 1935 г.), Б - Герберт Бойер (Herbert Boyer, родился в 1936 г.).

Для создания генетически измененных организмов подбирают вектор - молекулу ДНК, способную к самостоятельной репликации в клетке-реципиенте. Затем выделяют требуемый для клонирования ген, соединяют его с вектором и полученную рекомбинантную молекулу ДНК вводят в подходящую клеткуреципиент. Таким образом, при конструировании рекомбинантной молекулы ДНК можно выделить следующие этапы:

1.Подбор вектора – молекулы ДНК, способной к репликации в клетке.

2.Выделение интересующих генов из ДНК клетки - донора.

3.Создание рекомбинантной генетической конструкции:

3.1.Разрезание (рестрикция) ДНК донора и ДНК вектора специфическими ферментами – рестриктазами (генетическими ножницами).

3.2.Соединение (лигирование) ДНК донора и ДНК вектора с помощью специфических ферментов - лигаз.

4. Введение полученной рекомбинантной молекулы ДНК в реципиентную

клетку.

5. Отбор и идентификация клеток, экспрессирующих введенный ген.

В качестве вектора используют плазмиды, фаги или вирусы. Вектор должен содержать маркерные гены, которые придают клетке – реципиенту новые свойства, позволяющие отличить эту бактериальную клетку от исходных клеток. Чаще всего в качестве вектора применяют R-плазмиды, так как они позволяют проводить селекцию гибридных клонов по признаку устойчивости к антибиотикам. Схема клонирования чужеродного гена в бактериальной клетке представлена на рисунке

10.49.

310

Чужеродный ген Плазмида Клетка-реципиент

Рекомбинантная молекула ДНК

Рисунок 10.49 - Схема получения рекомбинантной молекулы ДНК.

При конструировании рекомбинантной ДНК используют специфические ферменты – рестриктазы и лигазы. Рестрикционные эндонуклеазы или рестриктазы узнают и расщепляют определенные последовательности ДНК, специфические для каждого фермента по длине и структуре (рисунок 10.50).

Рисунок 10.50 – Схема расщепления ДНК рестриктазами EcoRI и BamHI.

К настоящему времени из различных микроорганизмов выделено более тысячи рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используется около 200 рестриктаз. Одни рестриктазы разрезают ДНК по оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие - со сдвигом, с образованием “ступеньки”. В первом случае образуются так называемые “тупые” концы ДНК, а во втором – “липкие” концы, то есть фрагменты ДНК имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки.

ДНК-лигазы – это ферменты, соединяющие (сшивающие) фрагменты ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Сшивание фрагментов ДНК осуществляется по “липким” концам или с помощью искусственно достроенных “липких” концов. Сшивание фрагментов ДНК по “липким” концам происходит в результате спаривания оснований за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов. При отсутствии комплементарных “липких” концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, используя так называемые линкеры (переходники) - короткие участки ДНК, имеющие разные “липкие” концы. Возможно сшивание фрагментов и по “тупым”