3 курс / Микробиология / инт09 (Ретровирусы. Вирус иммунодефицита человека. Лабораторная диагностика)
.docxВИРУСОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВИЧ/СПИД
Классификация. Семейство Retroviridae, род Lentivirus, ВИЧ1 и ВИЧ2.
Вирус иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1)
Материалом для исследования может быть кровь, лейкоциты периферической крови, спинномозговая жидкость, грудное молоко, сперма, биоптаты при аутопсии (пунктат лимфатических узлов и костного мозга).
Используют: экспресс-метод (электронная микроскопия, реакция непрямой иммунофлуоресценции, реакция молекулярной гибридизации), серологический и вирусологический методы диагностики.
Экспресс-метод. Обнаружение вирусных антигенов в крови и лимфоцитах с помощью ИФА.
Реакция молекулярной гибридизации.
Принцип ее заключается в том, что в условиях in vitro вызывается процесс гибридизации между вирусной нуклеиновой кислотой (ДНК, РНК) и специальным зондом, меченным радиоактивным фосфором 32Р. Образующийся комплекс достаточно легко идентифицировать с помощью авторадиографии. Однако использование 32Р-зондов в определенной степени усложняет этот метод, поскольку они имеют короткий (2 недели) период полураспада, требуют соблюдения строгих правил техники безопасности при работе с радиоактивными изотопами подобное. Учитывая это, перспективным направлением является использование зондов, которые можно обнаружить с помощью цветных ферментативных реакций. Такой меткой является биотин (биотиновый зонд).
Существуют различные варианты молекулярной гибридизации, среди которых чаще всего применяются точечная гибридизация, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ (в зараженных тканях). Одним из вариантов молекулярной гибридизации рассматривается полимеразная-цепная реакция, в основе которой лежит амплификация генов. Использование ДНК-полимеразы, например, с Thermophylus aquaticus позволяет за несколько циклов амплификации значительно увеличить количество исследуемых нуклеиновых кислот, вследствие чего их можно обнаружить любыми известными методами – ИФА, электрофорез в полиакриламидном геле. Эта реакция существенно превышает чувствительность предыдущего метода (на несколько порядков), поэтому может быть использована при исследовании микрообъемов материала или таких тест-объектов, где другими методами вирусы иммунодефицита не проявляются, например, смывы из носоглотки, слюна.
Обнаружение РНК вирусов в крови реакцией RT-ПЦР. Реакция основана на преобразовании вирусной РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием фермента обратной транскриптазы (RT) и амплификации полученной кДНК методом ПЦР – применяется для определения уровня вирусемии. Чувствительность метода позволяет обнаруживать вирус в малых концентрациях.
Серологический метод диагностики
Серологический метод диагностики ВИЧ-1-инфекции включает:
1. ИФА, позволяющий выявлять антитела к ВИЧ-1. В реакции используют антигены ВИЧ-1, выделенные из зараженных клеточных культур, или полученные с помощью рекомбинантных ДНК. ИФА неприемлем в серонегативный период ВИЧ-1-инфекции;
2. Вестернблот (иммуноблот) тест, применяемый для подтверждения факта ВИЧ-1-инфекции. Тест позволяет обнаружить специфические антитела в сыворотке и подтвердить диагноз. Результаты рассматриваются как положительные после обнаружения антител к р24, р31, а также к gp41 или к gp120. В методе иммунного блотинга проводится электрофоретическое разделение вирусных белков с последующим перенесением их на мембраны из нитроцеллюлозы. Затем мембрана обрабатывается испытуемой сывороткой. Заключительный этап исследования состоит в выявлении антител к различным белкам ВИЧ-1. Для этого в систему добавляют антивидовые меченые сыворотки. Индикацию образующихся иммунных комплексов проводят с использованием ИФА или РИА. Метод иммунного блотинга позволяет выявить антитела к одному или нескольким оболочечным или ядерным белкам ВИЧ-1.
Бесспорно положительными считаются сыворотки крови, дающие окрашивание на нитроцеллюлозной мембране в виде полос, соответствующих белкам р24, р31 и gp41 или gp120/160.
Вероятно, положительными считаются сыворотки, дающие окрашивания на нитроцеллюлозной мембране в виде полос, соответствующих белкам:
а) р24 и gp41 или gp120/160;
б) р31 и gp41 или gp120/160;
в) gp41 или gp120/160.
Сомнительными считаются сыворотки крови, дающие окрашивание в проекции белков: р24, р31, gp41 или gp120/160.
Отрицательными считаются сыворотки крови при полном отсутствии окрашивания на нитроцеллюлозной мембране.
Вирусологический метод
Вирусологический метод эффективен даже в серонегативном периоде ВИЧ-1-инфекции. Цель метода – индикация вирусов в культуре Т-хелперов с последующей их идентификацией.
Используют:
1) перевиваемые культуры лейкозных Т-хелперов;
2) первичные культуры Т-хелперов, выделенные из периферической крови и лимфатических узлов здоровых людей, стимулированные интерлейкином-2;
3) монослойные культуры астроцитов.
В культурах Т-хелперов ВИЧ-1 вызывают образование синцитиев с последующей гибелью клеток. Среди животных к ВИЧ-1 восприимчивы шимпанзе.
Вирус иммунодефицита человека II типа (ВИЧ-2)
Лабораторная диагностика заболевания аналогична для ВИЧ-1-инфекции.