Презентации 2020 / 05-20-DNAGenom structures
.pdf
Геномика и протеомика
Модуль II. Геномика
Тема 4. Структурная геномика
Лекция 5. Анализ последовательностей и организация геномов
•4.5.1. Распознавание генов
•4.5.2. Регуляторные последовательности генома
•4.5.3. Идентификация генов: методы обратной генетики
•4.5.4. Редактирование геномов
•4.5.5. Прокариотический геном
•4.5.6. Геном эукариот
•4.5.7. Геномы органелл
•4.5.8. Минимальный геном: Синтия 3.0
•4.5.9. Геномы вирусов
1
Анализ генома: распознавание генов
= Поиск ОРС (ORF – открытых рамок считывания)
Промотор – |
Терминатор |
|
|
сайт инициации |
транскрипции |
|
|
транскрипции |
|
Ген |
|
мРНК
Белок
N-конец |
С-конец |
Упрощенная схема структуры гена и его экспрессии. Обязательно наличие стартового кодона ATG (для Мет) и одного из стоп-кодонов для трансляции. Все это ограничивает открытую рамку считывания, кодирующую полипептид (если ОРС (ORF) не подвергается отбору, частота встречаемости стоп-кодонов ~1 на 20 кодонов). Большинство
эукариотических генов в своем составе имееют интроны – некодирующие внутригенные
2
вставки, удаляемые при созревании мРНК – сплайсинге.
Анализ генома: распознавание генов Экзоны и Интроны
Экзоны, вероятно, соответствуют структурно автономным доменам белка. Ранние интроны, вероятно, способствовали рекомбинации.
Один из путей появления новых белков – тасование экзонов
Большинство эукариотических генов в своем составе имееют интроны – некодирующие
внутригенные вставки, удаляемые при созревании мРНК – сплайсинге. |
3 |
Альтернативный сплайсинг
Схема образования различных мРНК из одного тропомиозинового гена в
. различных клетках. Некоторые интроны, принадлежащие одному гену могут сплайсироваться несколькими способами. Пример: в клетках щитовидной железы кальцитониновый ген экспрессируется в виде гормона кальцитонина, а в клетках гипофиза - нейропептида CGRP. Ген один - разные белки.
Возможен также транс-сплайсинг - форма сплайсинга, при которой |
4 |
соединяются РНК разных транскриптов |
|
Анализ генома: регуляторные последовательности
Промотор – Core: сайт посадки РНК-полимеразы, TATA-box, старт транскрипции
E.coli. Консенсус:
-10 – ТАТААТ-Прибнов-бокс
-35 – TTGACA
Размер прокар.: 100-1000 bp.
Эукариоты.
Консенсус: ТАТА-бокс около -30 (-TATAAA-)
СААТ-бокс в около -80 (-CCAAT-)
Функция – облегчение расплетания ДНК У большей части генов
человека и позвоночных отсутствует.
Есть более сложный тип промоторов с CG-бокс
5
Геномика и протеомика
Анализ генома: регуляторные последовательности
Энхансер – посл-ть ДНК после связывания транскрипционных факторов стимулирует транскрипцию одного или группы генов Сайленсер - снижает транскрипцию
Проект FANTOM 2000-2014 (RIKEN вел): описано 180 000 промоторных последовательностей и 44 000 последовательностей-энхансеров у человека и мыши, для ~95% генов. Построены карты.
Один из выводов: болезнетворные мутации в основном в регуляторных областях.
Эук: 3 РНК-полимеразы - I, II и III. Гены, кодирующие белки - Pol №2
Транскрипционный комплекс Эук. состоит примерно из 60 взаимодействующих белков, собирающихся вокруг полимеразы и имеет массу, превышающую 3МДа.
6
Геномика и протеомика
Анализ генома: регуляторные последовательности
•Boundary elements – Граничные элементы:
•Insulators – цис-регуляторные посл-ти ДНК, обладают способностью защищать гены от сигналов, приходящих от соседней ДНК.
Размер: типично 300-2000 bp Функции:
1.Блокировка энхансер, предотвращают действие дистальных энхансеров на промотор соседних генов.
2.Барьерные инсуляторы предотвращают инактивацию эухроматина за счет распространения соседнего гетерохроматина.
7
Геномика и протеомика
Идентификация генов: методы обратной генетики
Направленная инактивация гена..
1. Нокаут (knockout) генов гомологичной рекомбинацией
(выключение с изменением хромос-й ДНК, долго и дорого)
Основной объект – мыши
8
Геномика и протеомика
Идентификация генов: методы обратной генетики
Направленная инактивация гена – основные методы:
1. Нокдаун гена - снижение экспрессии разными методами на всех уровнях: блокирование транскрипции и трансляции, деградация мРНК…
А) РНК интерференция (RNAi) – инактивация гена путем деградации мРНК: антисмысловые и ds малые некодирующие РНК (siRNA, 21-25 ), внутр. или внешн., посттранскрипционно регулирующие экспрессию через RISC (RNA-induced silencing complex). Мишень – кодирующ. область. Механизм защиты от вирусов, транспозонов. Функция генов - быстро и недорого.
Б) МикроРНК (MicroRNA, miRNA 21-25) – кодируются генами, мишень – 3’-
некодирующ. область блок трансляции. Неполное спаривание регуляция многих сходных мРНК
2. Редактирование генома – серия
методов. Системы CRISPR-Cas
9
Геномика и протеомика
Редактирование генома
I. CRISPR/Cas основана на иммунной системе бактерий (Фрагменты чужой
ДНК 30-40 после контакта остаются в геноме, РНК с них связ-ся с чуж ДНК и разруш-ся Cas-белками)
1.CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
2.Cas-белки (CRISPR-associated sequence), узнает 20-30 bp
2013 – показано, что работает в клетках млекопитающих
2015 – 1-я попытка редактировать геном человека с
CRISPR/Cas9
10
Геномика и протеомика