Механизмы биологических реакций на костные имплантаты

Рекрутирование и активация нейтрофилов, или полиморфноядерных лейкоцитов, polymorphonuclear leukocytes (PMNs). - reactive oxygen species (ROS) [10], - высвобождение протеолитических ферментов и активных форм кислорода (ROS) – коррозия имплантата

Л быстро истощаются, подвергаясь апоптозу и исчезновение из мест имплантации в пределах первые два дня

Активация и дегрануляция тучных клеток приводит к высвобождению усиливающих воспаление цитокинов и гистамина, которые усиливают иммунную реакцию

Хемоатрактанты и активация цитокинов привлекают моноцитов из кровотока – в зону капсулы вокруг имплантата, где они дифференцируются в макрофаги

Макрофаги способны поглотить частицы размером до 5 мм, а если размер частиц больше, макрофаги объединяются, формируя гигантские клетки инородноых тел (FBGCs), что стимулируется IL-4 и IL-13

Инородные компоненты и молекулы, высвобождаемые в течение имплантационного периода из организма хозяина хозяина могут положительно регулировать остеогенную дифференцировку чтобы сформировать новую кость на поверхности имплантата и включить частицы имплантта в фазе ремоделирования кости. Новообразованная кость подвергается функциональному ремоделированию и имплантационные материалы, такие как биокерамика на основе Ca – P, могут подвергаться дальнейшей деградации.

Функциональная нагрузка и механическая нагрузка являются основной причиной для ремоделирования. Известно, что остеоциты транслируют сигналы связанные с механическим напряжением в биохимические сигналы и регулируют остеобласты и остеокласты и, следовательно, могут играть регуляторную роль на этом позднем этапе.

Между иммунной системой и системой скелетных тканей существуют тесные взаимодействия.

Взаимодействия иммунной системы и системы новообразования и ремоделирования кости представляет собой «обоюдоострый меч» :

Благоприятная иммунная реакция создает остеогенное микроокружение, которая способствует остеогенезу, тогда как неправильная иммунная реакция может привести к хроническому воспалению и формированию фиброзной капсулы вокруг имплантата.

Капсула, образованная в результате реакции на инородное тело (FBR) эффективно отделяет имплантат от окружающей среды, так что он может безопасно оставаться в организме хозяина на протяжении всего периода жизни.

Тем не менее, в случае кости, это делает имплантат «инертной» механической опорой, и развивается неблагоприятный сценарий, так имплантация биоматериала предназначена для образования новой кости и заполнения дефектного пространства полностью функциональной костью. Фиброзное инкапсулирование предотвращает прямое взаимодействие между костным мозгом и имплантатами, так что клетки костного мозга не могут напрямую прикрепиться к поверхности имплантатов для образования новой кости. Вместо этого дефект будет заполнен фиброзной тканью, что приведет к невозможности восстановления кости. Это иллюстрирует важность создания локальной иммунной среды, которая способствует регенерации кости и остеоинтеграции имплантата;

Таким образом, в случае некоторых материалов необходимо манипулирование иммунным ответом организма посредством целенаправленных модификаций костных биоматериалов.

Иммунная система - костеобразование

Нарушение функционирования иммунных клеток может привести к дисбалансу между остеокластами и остеобластами и привести к таким состояниям, как остеолиз, остеопороз, остеоартроз и ревматоидный артрит.

Иммунные клетки регулируют остеокластогенез с помощью трех основных цитокинов: макрофаг-колониестимулирующий фактор (M-CSF), рецептор-активатор лиганда NF-kB (RANKL) и остеопротег(е)рин (OPG).

M-CSF связывается со своим родственным рецептором c-FMS на предшественниках остеокластов и передает сигналы посредством путей киназы Akt и MAP [19]. RANKL связывается с RANK, рецептором на поверхности предшественников остеокластов, тем самым трансдуцируя через фактор 6, связанный с рецептором TNF (TRAF6), NF-kB, белок-активатор 1 (AP-1) и ядерный фактор активированных Т-клеток 2 (NFAT2) усиливают экспрессию генов для выживания и дифференцировки остеокластов [5,20]. RANKL экспрессируется не только остеобластическими клетками, которые поддерживают нормальный остеокластогенез в костной ткани, но также активированными Т-клетками и нейтрофилами, что указывает на участие этих иммунных клеток во время остеокластогенеза [21,22]. Макрофаги являются предшественниками остеокластов, которые при стимуляции M-CSF и RANKL могут дифференцироваться в остеокласты во время ремоделирования кости.

IL-6 и онкостатин М (OSM) являются важными медиаторами образования и функционирования остеокластов. Известно, что IL-6 индуцирует экспрессию RANKL и использует систему RANKL / RANK-OPG для выявления косвенных эффектов, способствующих развитию остеокластогенеза и активации остеокластов [23,24]. Также обнаружено, что IL-6 участвует в образовании остеокластов, индуцированных TNF-α и IL-1 [25]. OSM использует gp130, ту же субъединицу рецептора, что и IL-6, для передачи сигналов, и эти два цитокина часто имеют сходные и перекрывающиеся функции [26]. OSM также может стимулировать выработку RANKL остеобластами и усиливать образование остеокластов дозозависимым образом, что может быть связано с его синергетическим эффектом с IL-6 [27,28]. Напротив, интерферон-g (IFN g) способствует деградации TRAF6, ключевого промежуточного звена в пути RANKL / RANK, тем самым предотвращая массивное разрушение кости во время воспаления [5].

OPG, рецептор-ловушка для RANKL, прерывает взаимодействие RANKL / RANK, тем самым ингибируя как дифференцировку, так и функцию остеокластов [29,30]. Было показано, что В-клетки являются основным источником OPG, полученного из костного мозга [31,32], что означает, что В-клетки являются одним из основных ингибиторов остеокластогенеза в нормальной физиологии. Истощение подмножеств CD4 и CD8 Т-лимфоцитов у мышей приводит к образованию остеокласта, стимулированного витамином D3, посредством механизма, включающего повышенную регуляцию выработки простагландина Е [32,33].

Обнаружено, что Т-клетки работают совместно с В-клетками и увеличивают продукцию OPG путем костимуляции CD40 / CD40L, основываясь на данных, показывающих, что мыши с дефицитом Т-клеток CD40 и CD40L-нокауты являются остеопорозными [31].

Тучные клетки также активно участвуют в остеокластогенезе [34]. Уменьшение количества тучных клеток уменьшает ремоделирование кости, тогда как системное усиление образования ТК приводит к увеличению потери костной массы.

Взаимодействие между иммунными клетками и клетками остеокластов играет ключевую роль в патолофизиологии многих заболеваний костей, таких как остеоартрит, ревматоидный артрит. Постоянное чрезмерное воспаление является признаком непрерывного высвобождения провоспалительных цитокинов (TNF-a, IL-1a / b и IL-6) и обычно сопровождает повышенное соотношение RANKL / OPG и повышенную активность остеокластов [39]. Результатом является сдвиг ремоделирования кости в сторону прогрессирующих эрозий костей, опосредованных остеокластами, которые характеризуются нарушением минеральных и органических компонентов, что приводит к чрезмерной потере костной массы и дисфункциональности костных органов.

Иммунные клетки играют незаменимую регуляторную роль в остеогенезе. Они могут действовать положительно в процессе регенерации кости. Резидентные макрофаги (остеомаки) имеют решающее значение для эффективной минерализации остеобластов, поскольку истощение макрофагов приводит к полной потере опосредованного остеобластами формирования кости in vivo [40]. Заживление переломов костей значительно улучшается у нокаутированных мышей, у которых отсутствуют Т и В-клетки, что указывает на то, что они также могут иметь тормозную функцию во время этого процесса [41,42]. Эти данные вместе подтверждают двойственную роль иммунных клеток в остеогенезе, благодаря их экспрессии и секреции широкого круга регуляторных молекул [43], таких как воспалительные цитокины, костный морфогенетический белок 2 (BMP2), трансформирующий фактор роста b (TGF-b). ), и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) [44,45].

Комбинация из четырех основных воспалительных цитокинов, TNF-a, TGF-b, IFN-g и IL-17 в физиологических концентрациях, может индуцировать выработку минерализованного матрикса так же эффективно, как дексаметазон, обычно применяемая добавка для остеогенной среды [46]. ,

Обнаружено, что TNF-α повышает активность и минерализацию щелочной фосфатазы (ALP) мезенхимальными стромальными клетками (MSC) дозозависимым образом путем активации сигнального пути NF-kB [47,48].

Стимулирующее действие кондиционированной среды из активированных липополисахаридом (LPS) воспалительных макрофагов M1 на активность ALP ослабляется, когда кондиционированную среду предварительно обрабатывают нейтрализующим TNF-антителом [46]. Также обнаружено, что нокаут IL-6 задерживает созревание, минерализацию и ремоделирование каллуса, что указывает на существенную роль IL-6 на ранних стадиях заживления переломов [49], в то время как нокаут OSM на ранней стадии приводит к уменьшению количества новой кости [50].

Однако ингибирующее действие TNF-a также наблюдалось на дифференцировку остеобластных клеток, подавляя высвобождение BMP2 и вызывая проапоптотические эффекты на остеобласты [51,52]. Полагают, что активация IFN-g и TNF-a Т-лимфоцитами также ответственна за неспособность регенерации костной ткани на основе MSC, и ее ингибирующее действие может быть устранено применением аспирина (противовоспалительного препарата) [53]. , Механизм, лежащий в основе, может быть связан со стимуляцией NF-kB в МСК, которая способствует деградации b-катенина, тем самым ингибируя остеогенную дифференцировку [54]. Это обоснование приводит к гипотезе о том, что эффекты воспалительных цитокинов на остеогенез могут зависеть от дозы и времени, и что адекватная концентрация и подходящие сроки этих цитокинов могут индуцировать остеогенез. Обратная сторона этого заключается в том, что неадекватные концентрации и / или время стимуляции воспалительных цитокинов могут привести к резорбции кости.

Многочисленные роли макрофагов в процессе заживления костей

Макрофаги среди всех иммунных клеток, как правило, получают наибольшее внимание из-за их многочисленных ролей в процессе заживления костей и их высокой пластичности. Макрофаги играют центральную роль в воспалении и защите хозяина, особенно в ответной реакции врожденного иммунитета. На основании различных функциональных свойств, поверхностных маркеров и индукторов макрофаги условно разделены на фенотипы M1 и M2, что соответствует номенклатуре Th1 / Th2 для Т-хелперных клеток [55]. Макрофаги M2 включают три субпопуляции: M2a, M2b и M2c. Индукторы, поверхностные маркеры и функции каждого фенотипа суммированы на рис. 3. Следует отметить, что эта классификация представляет собой лишь упрощение сценария in vivo. Скорее всего, фенотип макрофагов занимает континуум между обозначениями M1 и M2, причем многие оттенки активации еще предстоит идентифицировать [56]. Это затрудняет выделение M1 из макрофагов M2, поскольку временные макрофаги могут обладать некоторыми характеристиками обоих фенотипов, что приводит к ненадежным поверхностным маркерам. Таким образом, полагаться на маркеры для обнаружения популяции макрофагов было бы проблематично, и требуются многочисленные критерии.

До сих пор нет единого мнения о том, какой фенотип макрофагов является наиболее полезным для остеогенеза. Хорошо известно, что классически активированные воспалительные макрофаги (М1) секретируют многие провоспалительные цитокины (TNFa, IL-6, IL-1b), которые, как традиционно признают, индуцируют остеокластогенез и усиливают остеокластическую активность, ведущую к резорбции кости.

Тем не менее, некоторые недавние исследования показали, что усиление остеогенеза вызывают макрофаги М1, а не на М2. Guihard et al. Сообщили, что классически активированные воспалительные M1, но не M2 макрофаги, индуцируют остеогенез в MSCs через OSM [57].

Сходные результаты можно найти в активированных LPS T-лимфоцитах M1, которые, как было установлено, секретируют высокие уровни BMP2, усиливая остеогенную дифференцировку MSCs [46].

Альтернативно активированные макрофаги М2 имеют тенденцию быть более тесно связанными с поздней стадией восстановления ткани, что приводит либо к 5. фиброзной капсуле (рис. 1b), либо к образованию новой кости (рис. 1а), путем секреции соответствующих цитокинов. Они не только вносят остеоиндуктивные и остеогенные цитокины, такие как BMP2 и VEGF, в процесс остеогенеза, но также вырабатывают воспалительные агенты и стимуляторы волокнообразования (TNFa, TGF-b1, TGF-b3) для формирования патологического фиброза [58,59] , В ответ на чрезмерное воспаление, индуцирующие фиброз фенотипы М2 будут стимулировать образование фиброзной капсулы, тем самым отделяя очаг воспалительной реакции от нормальной костной ткани. Это ограничивает воспаление и сохраняет нормальную костную ткань, что в противном случае привело бы к нарушению регенерации кости (Fig. 1b). С другой стороны, чрезмерное переключение на фенотип М2 приводит к образованию рубцовой ткани или замедлению заживления раны [9,60]. Следовательно, наиболее вероятно, что оба фенотипа макрофагов играют незаменимую роль в процессе заживления кости и что именно паттерн переключения макрофагов определяет остеогенез, а не конкретный фенотип макрофагов (рис. 1).

Костные биоматериалы распознаются иммунной системой хозяина как инородное тело, вызывая множественные направленные иммунные реакции. Биоматериалы являются не просто пассивными мишенями для атаки иммунных клеток, но вызывают значительные эффекты, которые определяют тип и степень опосредованных имплантатами иммунных реакций.

Свойства поверхности, размер частиц, пористость и высвобождаемые ионы из биоматериалов являются факторами, участвующими в этих реакциях

Поверхностные свойства костных биоматериалов

Биологическое поведение иммунных клеток на поверхности костных биоматериалов во многом определяется поверхностными свойствами, такими как микроструктура поверхности и смачиваемость [66–68].

Обычно гидрофобные материалы имеют тенденцию улучшать адгезию моноцитов по сравнению с гидрофильными материалами, что приводит к локальной иммунной реакции in situ [68,69]. Было обнаружено, что поверхности гидрофильного / нейтрального сополимера ингибируют адгезию и слияние макрофагов с FBGC. Однако прилипшие клетки продуцировали большие количества цитокинов (IL-6 и IL-1b) и хемокинов [IL-8, RANTES (регулируется при активации, нормальные Т-клетки экспрессируются и секретируются; также известен как CCL5), ENA-78 (эпителиальный -производный нейтрофил-активирующий пептид 78; также известный как CXCL5), и MCP-1 (хемотаксический белок 1 моноцитов; также известный как CCL2)], а не гидрофобный и гидрофильный [66,67].

Поверхностный заряд также оказывает значительное влияние на иммунный ответ. Общепринято, что катионные (положительно заряженные) частицы более способны стимулировать воспалительный ответ, чем анионные (отрицательно заряженные) и нейтральные вещества [70,71]. Большинство клеток млекопитающих, включая иммунные, имеют общий отрицательный поверхностный заряд [72]. Потеря отрицательного поверхностного заряда клеточной мембраны из-за положительно заряженных частиц может повлиять на локализацию и конформацию белка, что при нормальных обстоятельствах вызывает передачу сигнала в цитоплазму, что приводит к значительным биологическим реакциям, включая воспаление.

Топография поверхности биоматериалов является еще одним важным свойством, которое влияет на взаимодействие иммунных клеток [73–76]. Например, шероховатость титана влияет на прикрепление и распространение иммунных клеток: адгезия макрофагов увеличивается со временем на всех поверхностях (полированный, обработанный и подвергнутый пескоструйной обработке коммерчески чистого титана), тогда как распространение клеток увеличивается с увеличением шероховатости поверхности [75]. В дополнение к влиянию на прикрепление клеток шероховатость титана может также модулировать выработку воспалительных цитокинов и хемокинов макрофагами, при этом поверхность пескоструйной обработки и кислотного травления вызывают значительные стимулирующие эффекты [74].

Мы условно считаем, что шероховатость поверхности кости составляет около 32 нм, что делает наноматериалы потенциально наиболее биомимическими [77]. Обнаружено, что наноразмерные микроструктуры стимулируют MSC человека к выработке костных минералов in vitro даже в отсутствие остеогенных добавок. [78]. Также было обнаружено, что микроструктурированная, а не наноструктурная топография приводила макрофаги в активированное состояние, имеющее как характеристики М1, так и М2 [79], и поверхности титана, модифицированные массивами нанотрубок на основе диоксида титана, могут снижать иммунный ответ in vitro по сравнению с необработанной поверхностью того же материала [80].

Основные механизмы поверхностных свойств биоматериала, регулирующие иммунный ответ, могут быть связаны с тем, как они влияют на адсорбцию белков, таких как компоненты комплемента, фибриноген, фибронектин и витронектин. После адсорбции белковые структуры могут испытывать некоторые изменения, приводящие к экспозиции некоторых замаскированных доменов или эпитопов, которые затем могут распознаваться клетками-хозяевами (включая иммунные клетки). Связывание с этими эпитопами через специфические рецепторы позволяет клеткам-хозяевам прикрепляться к поверхностям материалов [81]. Начальная адсорбция белков образует временную матрицу на поверхности, которая затем становится важной связью между материалом и реакцией хозяина. По этой причине важно знать не только то, какие белки адсорбируются, но и то, как они взаимодействуют с поверхностью при определении последующего поведения клеток-хозяев [82]. Как химический состав поверхности, так и смачиваемость влияют на конформационные изменения адсорбированных белков и модулируют кинетику их адсорбции, силы связывания и активность белков [83]. Большинство белков в крови являются гидрофильными снаружи, тогда как их гидрофобные домены обращены внутрь, таким образом, сывороточные белки имеют тенденцию связываться на гидрофобных поверхностях [83,84].

Мы уже знаем, что компоненты комплемента, такие, как фибриноген, фибронектин и витронектин, прикрепляются к поверхности имплантата и оказывают существенное влияние на иммунный ответ [85,86].

Система комплемента участвует в биодеградации имплантатов, главным образом за счет усиления фагоцитоза имплантатов и привлечения макрофагов и нейтрофилов [86].

Прикрепление плазменного фибриногена обнажает фрагмент провоспалительной последовательности D30, который может связываться с интегрином Mac-1 (CD11b / CD18) на поверхности фагоцитов, активно участвуя в накоплении фагоцитов [85]. Фибриноген также может превращаться в фибриноподобную конформацию на поверхностях материала, облегчая связывание и активацию воспалительных клеток [85]. Также обнаружено, что плазменный фибронектин активно участвует в слиянии FBGCs, тем самым модулируя фиброзную инкапсуляцию имплантированных материалов [89]. Витронектин может адсорбироваться на поверхности в условиях конкуренции со стороны других белков плазмы [90], и было обнаружено, что он является жизненно важным белковым адгезионным субстратом для индуцированного IL-4 образования FBGCs [91,92].

Т.о., Адсорбция этих белков из плазмы на поверхности биоматериала может связываться с рецепторами интегрина на поверхности иммунных клеток, активируя сигнальные пути [85,93–95]. Интегрины широко охарактеризованы как рецепторы адгезии со способностью трансдуцировать внешние сигналы внутри клеток. Было высказано предположение, что интегрин b1 высоко экспрессируется на поверхности недифференцированных моноцитов, тогда как экспрессия интегрина b3 усиливается при дифференцировке макрофагов [96]. Во время образования FBGCs присутствуют интегрин-опосредованная адгезия как b1, так и b2, в то время как интегрин-опосредованная адгезия b3 не обнаруживается, процесс, который, как известно, играет важную роль в опосредовании адгезии остеокластов на поверхности кости [97]. Истощение интегрина b3 влияет на поляризацию макрофагов, переключая фенотип в крайнюю М2 [98]. Антитела против интегрина b2 могут частично блокировать адгезию макрофагов к имплантатам, снижая выработку IL-1b до базовых уровней, тогда как антитела против b1 и анти-avb3 не действуют [99]. Интегрины, ассоциированные с макрофагами, также участвуют в регуляции экспрессии BMP2: антисыворотка к интегрину b1 оказывает относительно большее влияние на экспрессию мРНК макрофагов BMP2, чем антисыворотка к интегрину b3 [75]. Следовательно, интегрины, вероятно, играют важную роль в передаче сигнала от матрицы, или рельефа, на поверхностях имплантата к иммунным клеткам, что приводит к прикреплению, распространению, делению и дифференцировке клеток.

В ответ на матричные сигналы интегрины могут также передавать сигналы внутрь клетки, воздействуя на цитоскелет (особенно микрофиламенты), тем самым изменяя морфологию клетки. Была также исследована корреляция морфологии макрофагов и продукции воспалительных цитокинов, возникающих при контакте с материалом, и макрофаги с амебоидной формой продуцируют больше TNFa по сравнению с макрофагами полусферической и сферической форм [100]. Предыдущие исследования также связывали морфологию распространения с уровнем активации, где уменьшение распространения клеток указывает на снижение уровня активации [76]. Из этих результатов также можно сделать вывод, что поверхностные свойства влияют на биологическое поведение иммунных клеток, воздействуя на цитоскелет. Цитохалазины могут связываться с актиновыми филаментами и блокировать актиновую полимеризацию и удлинение, тем самым подавляя цитоскелет-зависимое ремоделирование формы клеток [75, 101]. Цитохалазин D был применен для блокирования полимеризации актинового цитоскелета, и результаты показали, что интактный цитоскелет был необходим для генерации провоспалительного цитокина IL-1b [99]. Макрофаги не распространялись, но имели круглую форму в ответ на высокие концентрации (50 мМ) цитохалазина B, которые ингибировали экспрессию гена BMP2, усиливающего остеогенез [75].