Идентификация и подсчет макрофагов и моноцитов

Клетки окрашивают кристаллическим фиолетовым или нейтральным красным, идентифицируют и подсчитывают. В зависимости от густоты суспензии ее разводят в пипетке для лейкоцитов или эритроцитов раствором одного из красителей и переносят в камеру Biirker (смешивают 1 мл раствора кристаллического фиолетового с 10 мл цитрат/NaCl и 90 мл дистиллированной воды или 0,5 мл раствора нейтрального красного с 9 мл раствора Хенкса и 1 мл сыворотки эмбрионов коров, можно лошадиной). При окрашивании кристаллическим фиолетовым клетки подсчитывают через 5 минут после заполнения камеры, при окраске нейтральным красным подсчет ведут через 5— 10 мин после выдерживания камеры на подогретом до 37 °С столике. Кристаллический фиолетовый окрашивает ядра клеток. Это дает возможность отдифференцировать макрофаги и моноциты от лимфоцитов и гранулоцитов. Они выглядят как крупные клетки с круглым или овальным ядром. В их цитоплазме присутствуют светопреломляющие гранулы. Эритроциты при окраске лизируются, поскольку раствор кристаллического фиолетового сильно гипотоничен. Только макрофаги и моноциты прокрашиваются нейтральным красным, в вакуолях которых он откладывается. При подсчете клеток рекомендуется просчитывать 3 группы квадратов камеры Biirker по диагонали из левого верхнего угла в правый нижний. Расчет ведут по следующей формуле:

¹ Фактор разведения — величина, обратная степени разведения

Идентификацию макрофагов и моноцитов в культуре проводят по захвату ими нейтрального красного или коллоидного угля. Для этой цели к культуре клеток добавляют 0,2 мл разведенного нейтрального красного или 0,1 мл разведенной туши. Инкубируют смесь 10 мин при 37 °С и подсчитывают клетки, окрашенные нейтральным красным. Клетки, захватывающие тушь, подсчитывают через 30—60 мин инкубации после отмывания избытка туши. Подсчет клеток ведут под микроскопом, перевернув чашку Петри вверх дном.

Получение культур макрофагов и моноцитов

Готовят среду (Игла-МЕМ или RPMI 1640), добавляя 10 мл сыворотки эмбрионов коров или сыворотки человека группы АВ и 2 мл растворов антибиотиков к 88 мл среды. Сыворотку эмбрионов коров лучше использовать для улучшения культуры мышиных перитонеальных макрофагов, сыворотку АВ — для культивирования моноцитов из крови человека. Количество клеток, которое вносят в культуральную среду, определяется стоящей перед исследователем задачей.

После тщательного перемешивания с культуральной средой суспензию клеток разливают по чашкам Петри (2 мл на чашку), которые затем помещают в эксикатор. Клетки культивируют при 37 °С в водонасыщенной атмосфере, содержащей 7,5% СО₂. После 30—60-минутной инкубации неадгезировавшие клетки удаляют из чашек Петри. Для этого чашки помещают на 5 мин на качалку (60—80 качаний/мин). Надосадочную фракцию отсасывают шприцем, остающийся монослой клеток смывают раствором Хенкса. Для этого в чашки вносят по 2 мл раствора Хенкса и в течение 10 секунд резко качают их в горизонтальном направлении. Раствор Хенкса отсасывают, повторяют процесс отмывки 4 раза, затем инкубируют чашки 24 часа при 37 °С, предварительно добавив 2 мл свежей культуральной среды. В случае работы с перитонеальными клетками получают монослой, состоящий по меньшей мере на 98% из макрофагов. При постоянном культивировании макрофагов или моноцитов каждые 3—4 дня необходимо менять среду. При замене среды монослой клеток несколько раз отмывают раствором Хенкса для удаления погибших макрофагов.