Разделение клеток крови в градиенте плотности Получение мононуклеаров из крови: мононуклеары получают из гепаринизированной крови (10 me гепарина/мл),
Между величиной и плотностью клеток существует тесная взаимосвязь. Обычно меньшие по размеру клетки обладают относительно меньшим объемом цитоплазмы по сравнению с ядром и, следовательно, большей плотностью. Разумеется, из этого правила есть исключения. Клетки, различающиеся по .величине и плотности, могут быть разделены методом изопикнического пли изокинетического центрифугирования, а также осаждением в градиенте плотности. При изопикническом центрифугировании клетки располагаются в слоях градиента с соответствующей плотностью. В случае изокинетического центрифугирования в менее плотном градиенте клетки с большим диаметром седиментируют быстрее. Тот же принцип лежит в основе осаждения клеток в градиенте плотности.
Материалы и оборудование. Для работы необходимы: центрифуга с охлаждением, бакет-ротор, градиентный смеситель, вещества для формирования градиента, такие, как альбумин, сыворотка эмбрионов коров, фиколл, лимфопреп, перколл (Pharmacia, Швеция), визотраст или другие рентгеноконтрастные вещества.
Центрифугирование в градиенте плотности
Ввиду разнообразия применяемых методов фракционирования клеток в градиенте плотности невозможно в рамках настоящей главы дать их детальный разбор. В зависимости от биологического вида, органного происхождения, стадии жизненного цикла и активации плотность лимфоцитов, макрофагов, гранулоцитов варьирует в пределах 1,04—1,12 г/мл. Обычно разброс величин плотности составляет около половины этого интервала. Условия центрифугирования подбираются индивидуально в зависимости от характера эксперимента, основные варианты представлены в таблице:
И
зопикническое
центрифугирование клеток и градиенте
плотности фиколла
Если требуется разделить клетки в соответствии с их плотностью, но нет никаких предварительных указаний на то, как это сделать, можно попытаться разделить клетки в линейном градиенте, исследовать, в какой области градиента преобладает определенный тип клеток, а затем провести разделение в прерывистом градиенте.
Изопикническое разделение. В качестве одного из вариантов градиентного центрифугирования, помимо перечисленных в таблице, можно использовать следующий.
Градиентбычьий сывороточный альбумин15—28%; 3800 g в течение 45 минут или 4000 g в течение 30 минут. Разделению подвергаются лимфоциты мыши и крысы. При приготовлении градиента надо выбирать инертные, которые не диссоциируют на ионы и образуют водные растворы с низкой вязкостью.
Растворы таких веществ должны обладать незначительным осмотическим давлением во избежание повреждения разделяемых клеток. Лучше всего этим требованиям отвечают фиколл, перколл и альбумин. Альбумин предварительно должен быть отдпализирован, деионизирован, его рН должен быть доведен до 5,1. Это значение рН хорошо переносится клетками и препятствует образованию агрегатов. Диализ необходим для удаления солей, которые могут присутствовать в альбумине и повышать осмотическое давление. Добавлением гомологичной нормальной сыворотки разницу в осмотическом давлении можно еще уменьшить. На дно центрифужных пробирок часто наслаивают так называемую «подушку», т. е. небольшое количество раствора высокой плотности (45% фиколл или 40% альбумин). Затем вносят суспензию клеток в растворе фиколла или альбумина низкой плотности и подслаивают собственно градиент. Можно также примешивать клетки непосредственно к линейному градиенту, но при этом следует избегать образования агрегатов. После центрифугирования клетки отсасывают при помощи перистальтического насоса, собирают фракции, содержащие клетки. Жидкость из пробирки можно отсасывать сверху или снизу, через прокол в стенке пробирки.
Значительно чаще, чем непрерывный, используют ступенчатый градиент плотности. По своему составу градиенты могут значительно варьировать. Мы ограничимся только двумя примерами.
*Одновременное разделение эозинофилов, нейтрофилов и моноцитов человека в градиенте фиколл/гипак:
(A) 15,0 мл 9% фиколла + 10,0 мл 50% гипака; плотность 1,14 г/мл.
(Б) 17,5 мл 9% фиколла + 10,0 мл 50 гипака; плотность 1,13 г/мл.
(B) 20,0 мл 9% фиколла+10,0 мл 50% гипака; плотность 1,12 г/мл.
(Г) 24,0 мл 9% фиколла + 10,0 мл 50% гипака; плотность 1,06 г/мл.
Составляют градиент осторожно, наслаивая друг на друга по 2,0 мл растворов уменьшающейся плотности. Сверху наслаивают 2,0 мл гепаринизированной крови, разведенной в соотношения 1:2 0,15 М NaCl. Центрифугируют 40 минут при 1000 g и 22°С. Клетки распределяются тогда между различными слоями следующим образом: между плазмой и слоем Г — моноциты и лимфоциты с 97—100% чистотой, между Г и В — нейтрофилы с 94—99% чистотой, между В и Б — непрофилы (50—98%) и эозинофилы (2—50%), между Б и А —эозинофилы с 80—99% чистотой.