Задание 2. Определите концентрации хлорофиллов "а" и "б" в экстрактах из зеленых листьев

Измельчите ножницами два - три листа исследуемого растения, поместите измельченные листья в ступку и залейте несколькими миллилитрами 80 %-наго ацетона. Тщательно разотрите полученную кашицу и профильтруйте на воронке через бумажный фильтр. Приготовленная вытяжка не должна содержать никаких взвесей или быть мутной. В противном случае экстракт профильтруйте вторично. Сделайте несколько разведений экстракта в 80 %-ном ацетоне так, чтобы хоть одно из них имело поглощение в максимуме 660 нм около 0,5 - 1,0 шкалы D. Измерьте спектр поглощения этого раствора в прямо­ угольной кювете.

Известно, что поглощение в красной области спектра 600 - 750 нм определяется поглощением хлорофилла "а" и хлорофилла "б". Для хлорофилла "б" в 80 %- ном ацетоне максимум поглощения находится в области 640 нм, а для хлорофилла "а" - около 662 нм. Используя свойство аддитивности оптических плотностей при длинах волн 649 и 665 нм и переходя от молярных коэффициентов экстинкции, известных из таблиц, к удельным коэффициентам, получаем систему уравнений (учесть, что коэффициенты даны для толщины кюветы 1 см).

C_хл.а = 11,63 · D₆₆₅ – 2,39 · D₆₄₉ ,

C_хл.б = 20,11 · D₆₄₉ – 5,18 · D₆₆₅ .

Подставляя в уравнения значения D₆₄₉ и D₆₆₅, взятые из измеренного спектра, найдите величины концентраций хлорофиллов "а" и "б" (мг/л) в данном разведении.

Задание 3. 3ависимость поглощения от концентрации вещества

Приготовьте ацетоновую вытяжку аналогично тому, как указано в задании 2. Доведите раствор до 10 мл 80 %­ным ацетоном и разделите на две части по 5 мл. Из одной части приготовьте разведения в 2, 4, 8, 16, 32 раза, а другую оставьте без изменения. Следует обратить внимание на тщательность приготовления разведений, ибо от этого зависит точность построения зависимости поглощения от концентрации.

Установите прибор СФ-14 на длину волны 662 нм. Измерьте величины оптических плотностей D₆₆₂ для исходного раствора и разведений в 1 см прямоугольной кювете. В качестве контроля используйте кювету с растворителем (80 %-ным ацетоном) или воздух. Пометьте на бланке измеренные D. Затем переключите программу измерения прибора на, светопропускание и определите значение T₆₆₅ для разведений в той же кювете. Используя полученные значения D₆₆₂ и T₆₆₅, постройте графики зависимости D = f(C) и (1 - Т) = f’(С). По оси абсцисс отметьте концентрации С₀ (т.е. 1/32 С₀, 1/16 С₀, 1/8 С₀, 1/4 С₀, 1/2 С₀, С₀). Сравните концентрации, для которых сохраняется линейность по оптической плотности и поглощению (1 - Т). Применим ли закон Ламберта - Бера к исследуемому случаю?

Результаты измерений

Таблица 1 – Зависимость оптической плотности от концентрации (λ= 662 нм)

D, о.е.	С хл.а, мкл/л	C хл.б, мкл/л
2,893	50,4	43,68
1,446	25,2	21,84
1,134	12,6	10,92
0,669	6,3	5,46
0,382	3,15	2,73
0,18	1,575	1,365

График 1 – Зависимость оптической плотности от концентрации (λ= 662 нм)

График 2 – Спектры поглощения растительных пигментов

График 3 – Спектры поглощения растительных пигментов при различных концентрациях

Вывод

В эксперименте наблюдались спектры следующих длин волн пигментов: хл.а на длине волны 670 нм., хл.б = 650 нм.

Форма спектров поглощения вещества зависит от типа вещества и его состояния. Сдвиг спектров в воде и ацетоне обьясняется тем, что в ацетоне электроны находятся в более возбужденном состоянии.

Наблюдается соблюдение закона Бугера-Бера – с увеличением концентрации оптическая плотность вещества увеличивается пропорционально ей.