Лебухов ФХ методы исслдния292-325

Г Л А В А Ш Е С Т А Я

МЕТОДЫ

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО

АНАЛИЗА

Хроматография — это физико химический метод разде ления и анализа смесей газов, паров, жидкостей или ра створенных веществ сорбционными технологиями в ди намических условиях. Метод основан на различном рас пределении веществ между двумя несмешивающимися фазами — подвижной и неподвижной.

Подвижной фазой может быть жидкость или газ, не, подвижной — твердое вещество, которое называют носи телем. При движении подвижной фазы вдоль неподвиж ной компоненты смеси сорбируются на неподвижной фазе. Каждый компонент сорбируется в соответствии со срод ством к материалу неподвижной фазы (вследствие адсор бции или других механизмов). Поэтому неподвижную фазу называют также сорбентом. Захваченные сорбентом молекулы могут перейти в подвижную фазу и продвигать ся с ней дальше, затем снова сорбироваться.

Таким образом, хроматография — это процесс, осно ванный на многократном повторении актов сорбции и де сорбции вещества при перемещении его в потоке подвиж ной фазы вдоль неподвижного сорбента.

Чем сильнее сродство компонента к неподвижной фазе, тем сильнее он сорбируется и дольше задерживается на сорбенте, тем медленнее его продвижение вместе с под вижной фазой. Поскольку компоненты смеси обладают разным сродством к сорбенту, при перемещении смеси вдоль сорбента происходит разделение: одни компоненты

задерживаются в начале пути, другие продвигаются даль ше. В хроматографии сочетаются термодинамический (установление равновесия между фазами) и кинетический (движение компонентов с разной скоростью) процессы.

Хроматографический метод анализа был разработан русским ботаником М. С. Цветом в 1903 г. С помощью это го метода ему удалось разделить хлорофилл на составля ющие окрашенные вещества. При пропускании экстрак та хлорофилла через колонку, заполненную порошком мела, и промывании петролейным эфиром он получил не сколько окрашенных зон и назвал их хроматограммой (от греческого «хроматос» — цвет), а метод — хромато графией. Н. А. Измайлов и М. С. Шрайбер в 1938 г. раз работали новый вид хроматографии, названный тонко слойной. Они разделили алкалоиды, экстрагированные из лекарственных растений, на оксиде алюминия, нанесен ном на стекло.

Отправной точкой бурного развития многих методов хроматографического анализа является работа лауреатов Нобелевской премии А. Мартина и Р. Синджа, предложив ших в 1941 г. метод распределительной хроматографии. В 1952 г. А. Мартин и Л. Джеймс получили первые резуль таты в области газожидкостной хроматографии. Следстви ем этих работ стало огромное количество исследований, направленных на развитие метода газовой хроматографии.

За короткое время были усовершенствованы конст рукции систем ввода проб, созданы чувствительные де текторы. Метод газовой хроматографии — первый из хроматографических методов, получивший инструмен тальное обеспечение. Начиная с 1970 х годов происходит бурное развитие жидкостной хроматографии. К настояще му времени разработаны теория хроматографического про цесса и множество хроматографических методов анализа.

Среди разнообразных методов анализа хроматография отличается самой высокой степенью информативности благодаря одновременной реализации функций разделе ния, идентификации и определения. Кроме того, метод ис пользуется для концентрирования. Хроматографический метод анализа универсален и применим к разнообразным

294 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

объектам исследования (нефть, лекарственные препара ты, вещества растительного и животного происхождения, биологические жидкости, пищевые продукты и др.). Хро матография отличается высокой избирательностью и низ ким пределом обнаружения. Эффективность метода повы шается при сочетании с другими методами анализа, авто матизацией и компьютеризацией процесса разделения, обнаружения и количественного определения.

Различные методы хроматографии можно классифи цировать по агрегатному состоянию фаз, механизму раз деления, аппаратурному оформлению процесса (по фор ме) и по способу перемещения подвижной фазы и хрома тографируемой смеси.

По агрегатному состоянию фаз различают жидкост, ную и газовую хроматографию.

Разделение веществ протекает по разному в зависимо сти от природы сорбента и компонентов анализируемой смеси. По механизму взаимодействия вещества и сорбен та различают сорбционные методы, основанные на зако нах распределения (адсорбционная, распределительная, ионообменная хроматография и др.), и гель,фильтраци, онные (проникающая хроматография), основанные на раз личии размеров молекул разделяемых веществ. На прак тике часто реализуются несколько механизмов разделения одновременно. По технике выполнения хроматографию подразделяют на колоночную, когда разделение веществ проводится в специальных колонках, и плоскостную — тонкослойную и бумажную. При тонкослойной хромато графии разделение производится в тонком слое сорбента, при бумажной — на специальной бумаге.

Взависимости от агрегатного состояния фаз, механиз ма взаимодействия и оформления различают несколько основных видов хроматографии (табл. 6.1).

Всоответствии с режимом ввода пробы в хромато графическую систему различают фронтальную, элюент ную и вытеснительную хроматографию. Если растворен ную смесь непрерывно вводить в хроматографическую ко лонку, то в чистом виде можно выделить только одно, наиболее слабо сорбирующееся вещество. Все прочие ком

поненты выйдут из колонки в виде смеси. Этот метод назы вают фронтальным. В элюентном режиме через колонку пропускают подвижную фазу (элюент), вводят пробу, за тем снова пропускают подвижную фазу (ПФ). В процессе движения по колонке компоненты смеси разделяются на зоны, которые поочередно выходят из колонки, разделен ные зонами чистого растворителя.

В вытеснительном методе после введения пробы и пред варительного разделения слабоактивным элюентом состав элюента меняется таким образом, что он взаимодействует

296 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

с неподвижной фазой (НФ) каждого из компонентов ана лизируемой смеси. Вследствие этого новый элюент вытес няет компоненты, которые выходят из колонки в поряд ке возрастания взаимодействия с НФ. В этом методе из за частичного перекрывания зон достаточно полного разде ления не достигается.

Наибольшее распространение получил элюентный ре жим хроматографирования, позволяющий получать в чи стом виде все компоненты пробы. В жидкостной хрома тографии применяют изократический и градиентный ре жимы подачи элюента. В изократическом режиме состав элюента в течение анализа не изменяется, в градиент ном — меняется по определенной программе.

Рассмотрим особенности наиболее широко применяе мых видов хроматографии.

6.1. ЖИДКОСТНО АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НА КОЛОНКЕ

Разделение смеси веществ в адсорбционной колонке происходит по причине различия их сорбируемости на данном адсорбенте (в соответствии с законом адсорбцион ного замещения, открытого М. С. Цветом).

Адсорбентами являются пористые тела с сильно раз витой внутренней поверхностью, удерживающие жидко сти с помощью межмолекулярных и поверхностных явле ний. Это могут быть полярные и неполярные неорганиче ские и органические соединения.

Кполярным адсорбентам относятся силикагель (высу шенная желатинообразная двуокись кремния), оксид алю миния, карбонат кальция, целлюлоза, крахмал и др. Не полярные сорбенты — активированный уголь, порошок резины и множество других, полученных синтетическим путем.

Кадсорбентам предъявляют следующие требования:

они не должны вступать в химические реакции с под вижной фазой и разделяемыми веществами;

должны обладать механической прочностью;

зерна адсорбента должны быть одинаковой степени дисперсности.

При выборе условий для хроматографического процес са учитывают свойства адсорбента и адсорбируемых ве ществ.

В классическом варианте жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) через хроматографическую ко лонку, представляющую собой стеклянную трубку диа метром 0,5–5 см и длиной 20–100 см, заполненную сор бентом (НФ), пропускают элюент (ПФ). Под воздействи ем силы тяжести элюент движется; его скорость можно регулировать имеющимся в низу колонки краном. Ана лизируемую смесь помещают в верхнюю часть колонки. По мере продвижения пробы по колонке происходит раз деление компонентов. Через определенные промежутки времени отбирают фракции выделившегося из колонки элюента, который анализируют каким либо методом, по зволяющим измерять концентрации определяемых ве ществ.

Колоночная адсорбционная хроматография в настоя щее время применяется главным образом не как самосто ятельный метод анализа, а как способ предварительного (а иногда и конечного) разделения сложных смесей на бо лее простые, т. е. для подготовки к анализу другими ме тодами (в том числе и хроматографическими). Например, на колонке с окисью алюминия разделяют смесь токофе ролов, пропускают элюент и собирают фракцию а токо ферола для последующего определения фотометрическим методом.

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Вследствие медленного продвижения ПФ хроматогра фическое разделение смеси на колонке занимает много времени. Этого недостатка лишена высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЖХ). Для ускорения про цесса хроматографирование проводят под давлением.

Модернизация аппаратуры, применяемой в классичес кой жидкостной колоночной хроматографии, сделала этот

298 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

метод анализа одним из наиболее перспективных и со временных. ВЖХ является удобным способом разделе ния, препаративного выделения и проведения качествен ного и количественного анализа нелетучих термолабиль ных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в дан ном методе используют два варианта хроматографирова ния: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента — так называемая обращенно фазовая высокоэффективная жидкостная хро матография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в услови ях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Благодаря этому факту, а также удобству работы с водными и водно спиртовыми элюентами ОфВЖХ получила широкое рас пространение. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Аппаратура для ВЖХ. Комплект современного обору дования для ВЖХ (рис. 6.1), как правило, состоит из двух насосов 3, 4, управляемых микропроцессором 5 и подаю щих элюент по определенной программе. Насосы создают давление до 40 МПа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор или дозатор) 7 непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографи

Рис. 6.1

Схема современного жидкостного хроматографа:

1, 2 — сосуды с элюентами; 3, 4 — насосы; 5 — контроллер; 6 — смесительная камера; 7 — инжектор; 8 — колонка; 9 — детектор; 10 — регистратор; 11 — блок автоматической обработки результатов анализа; 12 — коллектор фракций; 13 — термостат.

ческую колонку 8 вещества детектируются высокочув ствительным проточным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается микро ЭВМ 11. При не обходимости в момент выхода пика автоматически отби раются фракции.

Колонки для ВЖХ выполняют из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2–6 мм и длиной 10–25 см. Ко лонки заполняют сорбентом (НФ). В качестве НФ исполь зуются силикагель, оксид алюминия или модифициро ванные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путем в его поверхность различные функциональные группы.

Детекторы. Выход компонента из колонки регист рируется с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от ПФ и связанного с природой и количеством компонента. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение в УФ области или светоиспускание выходящего раствора (спек трофотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекто ры), потенциал и электрическая проводимость (электро химические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал преобразуется, усиливается и регистрируется самописцем. Хроматограм ма представляет собой зафиксированную на ленте само писца последовательность сигналов детектора, вырабаты ваемых при выходе из колонки отдельных компонентов. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики.

Положение пика на хроматограмме используют для идентификации вещества, высоту или площадь пика — для количественного определения.

Качественный анализ. Важнейшие характеристики хроматограммы — время удерживания tR и связанный с ним удерживаемый объем — отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматогра фирования являются средством идентификации вещества.

300 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рис. 6.2

Параметры хроматограммы

Для данной колонки с определенными скоростью потока и температурой время удерживания каждого соединения постоянно. На рисунке 6.2 tR(A) — время удерживания ком понента А анализируемой смеси с момента ввода в колон ку до появления на выходе из колонки максимума пика, tR(BC) — время удерживания внутреннего стандарта (пер воначально отсутствующее в анализируемой смеси веще ство); h — высота пика (мм), а1/2 — ширина пика (мм) на половине его высоты.

Для идентификации вещества по хроматограмме обыч но используют стандартные образцы или чистые вещества: сравнивают время удерживания неизвестного компонен та tRx с временем удерживания tRCT известных веществ. Но более надежна идентификация по относительному вре мени удерживания:

Сначала вводят в колонку известное вещество (внутрен ний стандарт) и измеряют время его удерживания tR(BC), затем хроматографируют исследуемую смесь, в которую предварительно добавляют внутренний стандарт. Относи тельное время удерживания определяют по формуле (6.1).

Количественный анализ. В основе этого анализа лежит зависимость высоты пика h или его площади S от количе ства вещества. Для узких пиков предпочтительнее изме рение h, для широких размытых — S. Площадь пика из меряют разными способами: умножением высоты пика (h)

на ширину (а1/2), измеренную на половине его высоты (рис. 6.2); планиметрированием; с помощью интегратора. Современные хроматографы оснащены электрическими или электронными интеграторами.

Для определения содержания веществ в пробе исполь зуют в основном три метода: абсолютной градуировки, внутренней нормализации и внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предва рительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное коли чество градуировочной смеси, определяют площадь или высоту полученных пиков и строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного ве щества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градуировочного графика рассчитывают его количество.

Метод внутренней нормализации основан на приве дении к 100% суммы площадей всех пиков на хромато грамме.

Массовую долю в % одного компонента рассчитывают по формуле

где K — поправочные коэффициенты; SА, SВ, Si — площа ди пиков компонентов смеси.

Этот метод дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет опреде лить его абсолютную величину.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в

пробу. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси (рис. 6.2). Проводят анализ пробы с внутренним