Лебухов ФХ методы исслдния292-325

302 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

стандартом и рассчитывают количество определяемого вещества по формуле

где g(A) — количество определяемого компонента А; h(A) — высота пика компонента А; g(BC) — количество внутренне го стандарта; h(BC) — высота пика внутреннего стандарта; K(А) и K(ВС) — поправочные коэффициенты.

Впоследних двух методах требуется введение попра вочных коэффициентов, характеризующих чувствитель ность используемых детекторов к анализируемым веще ствам. Для разных типов детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности определяется эксперимен тально.

Вжидкостной адсорбционной хроматографии исполь зуется также анализ фракций растворов, собранных в мо мент выхода вещества из колонки. Анализ может быть проведен различными физико химическими методами.

Жидкостную адсорбционную хроматографию применя ют в первую очередь для разделения органических веществ. Этим методом весьма успешно изучают состав нефти, угле водородов, эффективно разделяют транс, и цис,изомеры, алкалоиды и др. С помощью ВЖХ можно идентифициро вать красители, органические кислоты, аминокислоты, сахара, примеси пестицидов и гербицидов, лекарственных веществ и других загрязнителей в пищевых продуктах.

6.2. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

В основе метода ионообменной хроматографии (ИХ) лежит динамический процесс замещения ионов, связан ных с неподвижной фазой, ионами элюента, поступающи ми в колонку.

Основная цель хроматографического процесса — раз деление органических и неорганических ионов с зарядом одного и того же знака.

Вкачестве ионообменников или ионитов обычно ис пользуют синтетические полимерные вещества. Они состо ят из матрицы (R) и активных групп, содержащих подвиж ные ионы. В зависимости от знака обмениваемых ионов различают катиониты и аниониты. Катиониты содержат кислотные группы различной силы, такие как сульфо группы, карбоксильные, оксифенильные. Аниониты име ют в своем составе основные группы, например алифати ческие или ароматические аминогруппы различной сте пени замещенности (вплоть до четвертичных).

Иониты могут находиться в Н и ОН форме, а также в солевой. В Н форме катиониты и ОН форме аниониты со держат способные к обмену ионы водорода и гидроксила соответственно, в солевых формах ионы водорода замене ны катионами металла, анионы гидроксила — анионами кислот.

Взависимости от силы кислотных и основных групп в

ионитах различают сильнокислотные (R–SO3H) и слабо кислотные (R–COOH) катиониты; сильноосновные (R–

N(CH3)3OH) и слабоосновные (R–NH3OH) аниониты. Сильнокислотные и сильноосновные иониты способ

ны к ионному обмену в широком диапазоне рH.

Процесс ионного обмена протекает стехиометрично. Например:

R–SO3H + Na+ * R–SO3Na + H+ ;

R–NH3OH + Cl– * R–NH3Cl + OH–.

Это ионообменное равновесие характеризуется кон стантой ионного обмена:

На основании констант ионного обмена построены ряды сродства ионов к данному иониту, позволяющие предви деть возможность ионообменных разделений.

В зависимости от сродства к фиксированным ионам не подвижной фазы разделяемые ионы перемещаются вдоль хроматографической колонки с различными скоростями: чем выше сродство, тем больше объем удерживания ком

304 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

понента. При разделении органических кислот и основа ний важную роль играет степень их диссоциации.

Для двух веществ, имеющих разные константы ион ного обмена, рассчитывают фактор разделения или коэф фициент разделения, который характеризует селектив ность ионита:

где FА/В — фактор разделения; KА, KВ — константы ион ного обмена веществ А и В. Чем больше фактор разделе ния, тем сильнее ионит удерживает вещество А.

Например, константы ионного обмена ионов железа (III) и кобальта (II) на сильнокислотном катионите марки КУ 2 составляют 3726 и 286 соответственно. Тогда соглас но формуле (6.4) получим

FFe3 /Co21 2 3726286 213.

Таким образом, можно сделать вывод, что катионит КУ 2 более селективен к ионам железа (III).

Важной количественной характеристикой ионитов яв ляется их обменная емкость. Полная обменная емкость определяется количеством эквивалентов ионов, обмени ваемых одним граммом сухого ионита. Чем больше обмен ная емкость, тем большую пробу можно ввести в колонку с ионитом.

При подготовке ионитов к работе их переводят в соот ветствующую форму. Так, для перевода катионита в Н форму через колонку с набухшим ионитом пропускают раствор сильной кислоты; избыток которой отмывают во дой. Затем медленно пропускают раствор смеси ионов. Каждый катион задерживается на ионите согласно своей сорбируемости. Далее пропускают подходящий элюент. Например, катионы щелочных металлов легко элюиру ются 0,1 М НСl. При этом ионы водорода обмениваются на сорбированные катионы, которые вместе с раствором выходят из колонки в соответствии с константами ионно го обмена. На выходе из колонки фракции собирают в от дельные сосуды и определяют содержание любым подхо дящим методом.

Иониты применяются для деионизации (обессолива ния) воды, очистки сахарных сиропов от минеральных солей; в препаративной химии — для концентрирования растворов; для определения ионов железа (III), меди и свин ца в вине; кальция и магния в молоке; различных метал лов в биологических жидкостях. Кроме того, ионный об мен используют для перевода ионов в форму, удобную для количественного определения. Например, поваренную соль в рассоле можно определить, пропустив пробу через ко лонку с катионитом, и выделившуюся в эквивалентном количестве кислоту оттитровать щелочью:

R – SO3H + NaCl = R – SO3Na + HCl.

Ионообменную хроматографию применяют для разде ления фенолов, карбоновых кислот, аминосахаров, пури новых, пиримидиновых и других оснований. Часто иони ты используют для предварительного разделения слож ных смесей на менее сложные. На ионном обмене основано получение ионитного молока для детского питания. С по мощью ионного обмена очищают натуральные соки от ионов тяжелых металлов. Ионообменные смолы приме няют для получения ионообменных мембран.

ИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Это один из вариантов разделения на ионитах, харак теризующийся более высокоэффективной техникой, чем обычно ионообменная хроматография. В методе ионной хроматографии используются поверхностнослойные сор бенты с небольшой емкостью и малым размером частиц (5–50 мкл), повышенное давление на входе в колонку (2– 5 МПа) и высокочувствительные детекторы с автоматиче ской записью сигнала.

Ионную хроматографию используют как экспрессный метод определения органических и неорганических ионо генных соединений. Применяют двух и одноколоночные варианты.

Двухколоночный вариант. В разделительной колонке, заполненной ионообменником низкой емкости, проводится

306 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

элюентное ионообменное разделение катионов или анио нов. В подавляющей (компенсационной) колонке, запол ненной ионообменником с высокой емкостью, осуществля ется подавление фонового сигнала элюента; детекция ионов происходит на кондуктометрическом детекторе. В качестве элюентов при анализе анионов используются гидроксиды щелочных металлов или соли слабых кислот, при анализе катионов — азотная или другая минеральная кислота.

Одноколоночный вариант. При использовании элю ентов с низкой электрической проводимостью кондукто метрический детектор присоединяют непосредственно к разделяющей колонке. В качестве элюентов применяют ароматические кислоты или их соли (бензойную кислоту, бензоат или фталат натрия); pH элюентов изменяются от 3 до 8. Используют и другие детекторы: спектрофотомет рический, люминесцентный, полярографический. В этом одно из преимуществ одноколоночного варианта. Однако пределы обнаружения ионов при одноколоночном вари анте ионной хроматографии обычно выше, чем при двух колоночном.

Методами ионной хроматографии определяют очень многие анионы в питьевой и технической воде, в продуктах технологической переработки в пищевой, фармацевтиче ской и других отраслях промышленности. Известны мето ды определения галогенидов, нитрита, нитрата, сульфата, ацетата и других ионов (всего свыше 70 анионов неоргани ческих и органических кислот). Методами ионной хрома тографии число катионов определяют значительно реже, главным образом катионы щелочных и щелочно земельных металлов, а также органические катионы замещенных со лей аммония. Определение многих других катионов оказы вается ненадежным, так как они выпадают в осадок в ком пенсационной колонке с сильноосновной смолой.

Таким образом, указанным методом определяются ка тионы щелочных и щелочноземельных металлов, а также органические катионы замещенных солей аммония. Ме тод также успешно применяется в анализе окружающей среды (атмосферы, воды и т. д.), в клинических исследо ваниях.

6.3. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Тонкослойная хроматография (ТСХ) является одним из наиболее простых и эффективных экспресс методов разделения и анализа веществ в пищевых продуктах, био логических жидкостях и других объектах, не требующих сложного оборудования. В то же время метод обладает высокой избирательностью и чувствительностью (низким пределом обнаружения). Этим методом можно определить 10–20 мкг вещества с точностью до 5–7%.

В зависимости от природы НФ тонкослойная хрома тография может быть адсорбционной и распределитель ной. Наиболее широко применяется первый вариант раз деления.

Неподвижная твердая фаза (оксид алюминия, сили кагель и др.) тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую (алюминиевая фольга) или пластмассовую пластинку и закрепляется с помощью крахмала или гип са (иногда используют пластинки с незакрепленным сло ем). Для хроматографирования подходят готовые плас тинки, выпускаемые промышленностью размером 5 15 и 20 20 см.

На расстоянии 2 см от края пластинки на стартовую линию с помощью микропипетки или микрошприца на носят пробы анализируемого раствора (диаметр пятен 3– 5 мм). После испарения растворителя край пластинки помещают в стеклянную камеру, на дно которой налит ра створитель (ПФ) в количестве, достаточном для образова ния слоя глубиной 0,5 см. Камеру закрывают крышкой.

Выбор растворителя (ПФ) зависит от природы сорбен та и свойств анализируемых соединений. Например, раз деление хлорорганических пестицидов на пластинке с си ликагелем производят в среде гексана. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов. Так, при хроматографировании аминокислот используют смесь Н бутанола с уксусной кислотой и водой, при анализе не органических ионов — водные буферные растворы, созда ющие постоянное значение рН.

Рис. 6.4

Хроматограмма жира:

I — полимеризованные и сильнополярные жиры; II — фосфолипиды; III — триглицериды; 1 — говяжье мясо; 2 — свинина; 3 — свинина с 20% печени; 4 — свинина с 40% печени; 5 — свинина с 50% печени; 6 — свиная печень.

ного соединения. Но практика показывает, насколько труд но создать постоянство всех факторов, от которых зави сит воспроизводимость значений Rf. На величину Rf влия ет качество и активность сорбента, его влажность, толщи на слоя, качество растворителей и другие факторы, не всегда поддающиеся достаточному контролю. Поэтому наряду с величиной Rf идентификацию проводят по «сви детелю». Стандартное вещество (свидетель), наличие ко торого предполагается в анализируемой смеси, наносят на линию старта рядом с исследуемой пробой. Таким обра зом, нанесенное стандартное вещество хроматографиру ется в тех же условиях.

После хроматографирования и детекции пятен срав нивают величины Rf определяемого вещества и «свиде теля».

Качественный анализ после разделения компонентов смеси методом ТСХ часто используют для определения состава пищевых продуктов. Так, на рисунке 6.4 представ лена хроматограмма жира, выделенного из мясного фар ша различного состава. Хроматографирование проводи ли на пластинках с силикагелем в системе гексан — ди этиловый эфир (в соотношении 3:1), пятна детектировали 10% раствором фосфорно молибденовой кислоты, иден тифицировали по голубому цвету зон на желтом фоне пла стинки. Как видно из хроматограммы, при данных усло виях произошло разделение фосфолипидов и триглицери дов. По характерному составу компонентов мяса и печени

310 ЧАСТЬ I. ТЕОРИЯ: ФИЗИКО ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

можно сделать вывод о натуральности мясного фарша в пробах 1–2 и добавках к нему печени в пробах 3–5.

Количественное определение в ТСХ можно сделать не посредственно на пластинке или после удаления веществ с нее. При определении на пластинке измеряют площадь пятна тем или иным способом (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному гра дуировочному графику находят количество вещества. За висимость между массой вещества q и площадью S на хро матограммах носит нелинейный характер и является ло гарифмической:

где а и в — эмпирические константы. Эта зависимость ли нейна для количеств вещества от 1 до 80–100 мкг.

Для построения градуировочного графика на пластин ку наносят растворы, содержащие разные количества стан дартного вещества, хроматографируют, проявляют зоны и измеряют их площади (рис. 6.5).

Более точен денситометрический метод определения веществ на хроматограммах (ошибка 1–2%). При денси тометрии производят измерение оптического поглощения проявленной хроматограммы сканирующим лучом в про ходящем или отраженном свете на специальных прибо рах — денситометрах (рис. 6.6).

На денситограмме получают пики, площадь которых пропорциональна содержанию вещества в пятне. Постро ив с помощью стандартов калибровочный график, изме ряют площадь пика компонента и по графику определяют его массу в пробе.

Все чаще используется также спектрофотоденсито, метрическое и флуориметрическое определение веществ на хроматограммах. В первом случае используют специ альные спектрофотоденситометры, измеряющие поглоще ние вещества в монохроматическом свете, во втором из меряют флуоресценцию пятна при облучении хроматог раммы УФ лучами. Широкое распространение получил способ экстрагирования компонентов из зон подходящим растворителем. При применении этого способа на хрома

Рис. 6.5

Зависимость площади пятен на хроматограмме от количества вещества:

а — хроматограмма; б — калибровочный график.

Рис. 6.6

Схема денситометра:

1 — протяжный механизм; 2 — источник света; 3 — хрома тограмма; 4 — фотоэлектрический преобразователь; 5 — уси литель; 6 — самописец.

тограмму наносят стандартный раствор и раствор пробы. Получив хроматограмму, ее обрабатывают, детектируя зону стандарта, вырезают часть хроматограммы с зоной компонента пробы и производят его экстрагирование под ходящим растворителем. Полученный раствор анализи руют инструментальным методом с высокой чувствитель ностью. Чаще всего применяют спектрофотометрические и фотоколориметрические методы. Если вещество не име ет цвета или не обладает поглощением в УФ области из лучения, то экстракт подвергают фотометрической реак ции, что позволяет получить интенсивно поглощающее производное вещества.