Выполнение спектрофотометрической идентификации веществ.
Повторно запустить анализ смеси стандартных ПАУ (см.пункт 10).
В процессе хроматографии, когда через фотометрическую ячейку протекает чистый элюат, необходимо сделать ПАУЗУ (кнопка PAUSE в меню) и запустить сканирование спектра нулевой линии: Управление\ Спектр\Нулевая Линия. Полученный спектр будет запомнен и, впоследствии, будет вычитаться из всех последующих спектров. Таким образом, будут сниматься спектры чистых пиков, без вклада спектра растворителя. Затем продолжить процесс хроматографирования, отжав кнопку меню RESUME.
При выходе каждого из трех веществ-стандартов ПАУ, сделать ПАУЗУ в точке наиболее близкой к вершине пика. В меню выбрать Управление\ Спектр, нажать СТАРТ - запустить сканирование спектра. Спектр отображается на экране в специальном окне и затем, после остановки сканирования - автоматически записывается в файл с расширением*.spm, размещается в той же поддиректории, что и файл хроматограммы. Продолжать хроматографирование после каждого останова.
Распечатать спектры: в меню Милихром А-02 Файл\Открыть выбрать файлы с расширением .spm, затем Файл\Печать. По каждому из трех полученных спектров определить оптимальные для анализа длины волн (волну, на которой поглощение света максимально).
Записать хроматограмму стандартной смеси еще раз в тех же условиях, но указав в таблице Детектора три выбранные длины волн. Обсудить вид хроматограммы, и различия в площадях пиков, записанных на разных длинах волн одновременно.
17. Для расчета спектральных соотношений для идентификации пиков веществ смеси записать хроматограмму в тех же условиях, указав в таблице Детектора длины волн: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 и 300 нм.
В программе «МультиХром» загрузить полученную хроматограмму Файл\Импортировать\Хроматограмму. Выдать и распечатать краткий отчет (см. п. 11) для первой длины волны. Далее для переключения волн выбрать в меню Метод\Настройка каналов. Щелкнуть в открывшемся окне на нужной длине волны, переместить ее стрелкой в верхний ряд таблицы, нажать Применить. Распечатать отчеты для остальных длин волн (см. выше).
Рассчитать спектральные соотношения площадей каждого пика на каждой из длин волн, отнесенные к площадям при длине волны λ=210 нм. Сравнить полученные спектральные соотношения, с таковыми в базе данных, выданной преподавателем, на этом основании проидентифицировать вещества. Результаты представить в виде таблицы в тетради, включающей имя каждого компонента, объем удерживания, и его спектральные соотношения.
Выполнение количественного анализа: абсолютная калибровка
Приготовить растворы нафталина в ацетонитриле трех концентраций: С1 = 5 мг/мл, С2= 2.5 мг/мл, С3=1 мг/мл.
Процедура приготовления растворов для калибровки: провести взвешивание вещества и приготовить раствор с максимальной концентрацией, затем рассчитать объем аликвот для растворов с меньшими концентрациями и приготовить их методом разведений.
Единой серией записать 3 хроматограммы с различной концентрацией нафталина в ацетонитриле, задав следующие условия хроматографического процесса:
В поле Автодозатор указать для каждой пробы (всего 3) ее номер в каретке и объем – 1 мкл;
В таблице Детектора: постоянная времени – 0,18 с; длина волны 250 нм;
В таблице Градиента: поток – 150 мкл/мин; регенерация – 0 мкл 50%, шаг 0 – 0 мкл 50% Б; шаг 1 – 400 мкл 50% Б;
В поле Описание/образец указать оператора, описать серию пробы -концентрации нафталина.
Сохранить настройки анализа, выбрав Сохранить как…
В пробирки налить по 50 мкл анализируемых смесей, закрыть пробками, установить в соответствующие позиции автосамплера.
СТАРТ запустить анализ.
22. Открыть программу «МультиХром» и провести построение градуировочного графика на основании растворов трех концентраций:
- Загрузить первую хроматограмму Файл\Импортировать\Хроматограмму. Убедиться, что на ней размечен один пик (цифра 1 над пиком), и нет разметки для следовых пиков. В обратном случае провести переразметку в окне Метод\Разметка;
- Выбрать в меню Метод\Градуировка\Компоненты, в диалоговой таблице щелкнуть кнопку Добавить - появляется новая строка, характеризующая компонент (пик 1), затем Концентрации; в появившейся таблице концентраций ввести в поле Единицы единицы измерения концентраций (мг/мл); в поле Точки щелкнуть Добавить.
- В открывшемся окне для точки 1 указать нужную концентрацию вещества (например 1) в поле Одинаковые концентрации; поставить галочку в поле Градуировать сразу, выйти ОК. Затем выйти из таблицы концентраций - ОК, и из таблицы компонентов – ОК.
- Проверить наличие градуировочной точки на графике в окне Метод\Градуировка\Графики. Далее обязательно сохранить метод в меню Файл\Сохранить метод как.
- Загрузить поочередно вторую и третью хроматограммы Файл\Импортировать\Хроматограмму. Выполнить с каждой вышеописанные операции, (но в таблице компонент добавлять уже не нужно, строка, соответствующая пику 1 имеется), указав точки 2 и 3 и соответствующие им концентрации.
- По окончании открыть сформированный градуировочный график Метод\Градуировка\Графики и распечатать его.
23. Определить концентрацию нафталина в исходной пробе ПАУ, загрузив первую хроматограмму в программе «МультиХром», с помощью полученного графика или таблицы концентрации (метод/градуировка/графики или метод/градуировка/концентрации).