Практическая работа 2.4. Ознакомление с конструкцией, приобретение навыков эксплуатации жидкостного хроматографа «Милихром А-02» и получение спектров ароматических соединений

Цель и содержание работы

Ознакомиться с основными блоками и схемой работы хроматографа «Милихром А-02», программой, управляющей настройками, сбором и записью данных. Записать хроматограмму смеси стандартных веществ и получить информацию об имеющихся пиках веществ и их количественных характеристиках с использованием программы обрабатывающей «МультиХром». Ознакомиться с работой спектрофотометрического детектора в сочетании жидкостной хроматографией, и получить представление о его информативности для идентификации органических веществ, на примере установления структуры полиароматических углеводородов путем анализа их спектральных соотношений. Освоить один из базовых методов определения концентрации веществ в хроматографии, а именно метод абсолютной калибровки. Определить концентрацию эталонного вещества - нафталина в растворе ацетонитрила данным методом.

Краткие теоретические сведения

Технические характеристики прибора: Хроматограф «Милихром А-02» является микроколоночным высокоэффективным прибором, оснащенным градиентной системой элюирования, автоматическим вводом пробы и спектрофотометрическим детектором. Он выполнен в виде портативного прибора и может использоваться в составе любых аналитических лабораторий, в том числе в составе подвижных (например, на водных судах).

Основные компоненты включают:

• двухкомпонентный градиентный насос шприцевого типа, который через шестипортовый двухходовой кран соединяется либо с резервуарами для элюентов А и В, либо со входами смесителя элюентов. В линии насоса А установлен датчик давления, включенный через дополнительный капилляр;

• автоматический дозатор, со съемной кассетой на 46 проб. На нем смонтирован узел инжекции и установлены резервуары для промывки инжекционной иглы и гнездо для слива элюента через иглу;

• подвижная инжекционная игла, для набора пробы, нанесения ее на колонку;

• хроматографическая колонка, помещенная в термостат, в котором нагревательным элементом и термометром служит прецизионная медная обмотка;

• спектрофотометрический детектор УФ - диапазона (190-360 нм).

В ВЭЖХ наиболее универсальным является спектрофотометрический детектор, измеряющий оптическую плотность элюата, вытекающего из колонки и проходящего через проточную кювету, при одной или нескольких длинах волн света. Оптическая плотность А вещества прямо пропорциональна высоте или площади хроматографического пика. Зависимость оптической плотности А от длины волны падающего на кювету с веществом света в диапазоне длин волн от 190-360 нм (сплошное излучение дейтериевой лампы) называется ультрафиолетовым спектром поглощения. УФ-спектры индивидуальны для каждого вещества, однако широкие полосы поглощения снижают их информативность для идентификации. Тем не менее, получение УФ-спектров веществ разделяемой смеси необходимо для определения оптимальной длины волны анализа, что позволяет значительно поднять порог обнаружения веществ.

Среди спектрофотометрических детекторов наибольшее распространение получили сканирующие УФ - спектрофотометры с быстрым циклическим переключением нескольких длин волн в процессе хроматографирования и с возможностью записи спектра в режиме остановки потока подвижной фазы. На одноволновой хроматограмме идентификация пика осуществляется только путем сравнения его времени удерживания с временем удерживания пика стандарта. Если хроматограмму записали на нескольких длинах волн одновременно, то каждому веществу на хроматограмме соответствует несколько пиков, записанных при разных длинах волн, и в качестве критерия идентификации можно использовать еще и соотношения площадей этих пиков (спектральные соотношения).

Для определения концентрации вещества в пробе необходимо выполнить калибровку - установление количественной зависимости площади пика от концентрации. В методе абсолютной калибровки из стандарта анализируемого веществ готовят ряд растворов с известными концентрациями, перекрывающими ожидаемый диапазон содержания в пробе. Далее эти растворы последовательно хроматографируют в одинаковых условиях и получают площади пиков, соответствующие концентрациям калибровочных растворов. На основании этих данных строят калибровочный график, обсчитываемый методом наименьших квадратов по линейной регрессии. Полученное уравнение зависимости концентрации от площади пика используется для расчета концентрации анализируемого вещества в пробах.

Материалы и оборудование:

- хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром А-02"; колонка Ø2х75 мм с обращенно-фазным сорбентом ProntoSIL 120-5C18 AQ # 1410;

- пипетки-дозаторы переменного объема 10÷100 мкл,

- стеклянные микропробирки с пробками на 50 мкл,

- ацетонитрил чистоты «для ВЭЖХ»,

- раствор веществ-стандартов (3 полиароматических углеводорода (ПАУ) в ацетонитриле)

- нафталин химически чистый,

- мерные колбы объемом 5 или 10 мл.