Презентация / Инженерная энзимология_лекция
.pdf
Рациональная инженерия
Выбор сайта мутации
Синтез олигонуклеотида, кодирующий новый аминокислотный остаток
Получение плазмиды, несущей олигонуклеотид
Получение клеток (трансфекция), в которых осуществляется биосинтез мутантного белка
При рациональной инженерии используются следующие подходы для получения ферментов со стабильной
конформацией и активностью:
• Стабилизация гидрофобного ядра
Данные CAST web-сервера позволяют определить какие аминокислотные замены необходимо произвести, чтобы удалить или уменьшить объем полостей в гидрофобной области, что повышает термостабильность фермента
• Уменьшение подвижности полипептидной цепи
Замена Гли на Ала (участвующим в гидрофобной стабилизации белка), замена
остатков АМК в местах изгиба цепи на Про (обладает жесткой конформацией), создание S-S- связей путем замены двух аминокислотных остатков на 2 Цис (пример: T4 лизоцим - данный подход повысил его термостабильность)
Замена аминокислотных остатков в активном центре
Замена Мет-222 на неокисляемую АМК в активном центре повышает устойчивость субтилизина BPN (ферментная добавка в моющих средствах) к действию пероксида водорода
Направленная эволюция ферментов
В отличие от рациональной инженерии,
направленная эволюция ферментов не требует информации о
структуре фермента, знания механизмов его инактивации или понимания молекулярных основ его стабильности.
Направленная эволюция ферментов
Создание библиотеки мутированных генов ферментов
Экспрессия генов в микробном хозяине
Скрининг или селекция продуктов экспрессии генов, для которых зафиксировано улучшение желаемого параметра
Рекомбинация фрагментов генов, кодирующих ферменты с улучшенными свойствами, с целью накопления полезных мутаций
Рекомбинация фрагментов гена in vitro (перемешивание ДНК или сексуальная ПЦР
DNA-shuffling or sexual PCR):
•ДНК, кодирующую различные варианты фермента, амплифицируют с помощью ПЦР
•амплифицированную ДНК фрагментируют случайным образом с помощью ДНКазы I
•пул образовавшихся фрагментов снова подвергают
ПЦР, в ходе которой фрагменты выступают друг для друга праймерами
•получают семейство последовательностей ДНК,
содержащих различные комбинации мутаций.
Рекомбинация фрагментов гена in vitro
Отличие от случайного мутагенеза
•Дает возможность одновременно улучшать сразу несколько параметров в
отличие от случайного мутагенеза
•Благодаря рекомбинации полезные
мутации, содержащиеся в разных генах, могут объединиться в одном.
•Продуктом такого гена будет
фермент, обладающий наряду с высокой каталитической активностью повышенной устойчивостью.
Данный методический прием позволяет быстро накапливать полезные мутации, идентифицированные в отдельных генах.
В результате рекомбинации элиминируются нежелательные (повреждающие) мутации
Примеры успешного применения направленной эволюция ферментов
Повышение термостабильности фермента.
Путем сравнения последовательностей мезофильного и термофильного вариантов α-амилазы была обнаружена мутация, стабилизирующая фермент. Комбинируя эту мутацию с новыми мутациями(полученными с помощью случайного мутагенеза) удалось увеличить
термостабильность амилазы на 11 °С. Кроме того, время ее полужизни при 90°С выросло в девять раз.
Повышение стабильности и активности фермента в органических растворителях.
В результате направленной эволюции был получен субтилизин Е, активность которого в 60 %-ном диметилформамиде была существенно выше, чем активность “дикого” фермента в водной среде.
В настоящее время значительное развитие получил перспективный подход к получению высокоактивных белков, основанный на использовании методов компьютерного молекулярного дизайна (технология
молекулярного докинга).
В качестве примера можно привести работу сотрудников биологического факультета МГУ по созданию эффективных биокатализаторовферментов, значительно превосходящих природные аналоги.
В качестве модели был взят фермент
пенициллинацилаза из Е.
Coli, который широко применяется в фармацевтических производствах для получения полусинтетических пенициллинов.
Его химическая и пространственная трехмерная структура известна. С помощью специально разработанной компьютерной программы было смоделировано улучшение свойств этого фермента. Для повышения активности и специфичности фермента виртуально варьировались аминокислотные остатки его активного центра, которые участвуют в связывании субстрата. Для каждой мутации проверялось (виртуально, методом молекулярного докинга) сродство новой формы активного центра фермента к субстрату
Мерой сродства служила величина энергии связывания субстрата с виртуальной молекулой фермента. Среди 3000
виртуальных форм фермента обнаружены мутантные формы,
связывающие субстрат почти в 100 раз лучше природного фермента.
Зная структуру такого высокоэффективного мутанта можно искусственно
сконструировать фрагмент ДНК, кодирующий его аминокислотную последовательность и в дальнейшем клонировать и
выбранных клетках-хозяине
ГETEPOГEHHЫE КАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ И КЛЕТОК
Процесс создания гетерогенных катализаторов путем связывания ферментов с носителями различной химической природы получил название иммобилизации.
Иммобилизованные ферменты более стабильны, используются многократно, активны в органических растворителях.