Частная бактериология
.pdf11
Стафилококки разжижают желатин в виде воронки, белки расщепляют до аммиака и сероводорода, не образуют индола.
Патогенные виды стафилококков (в частности, S. aureus) продуцируют плазмокоагулазу (коагулазоположительные) и фибринолизин. S. epidermidis и S. saprophyticus не продуцируют плазмокоагулазу (коагулазоотрицательные). Плазмокоагулазу и фибринолизин выявляют следующим образом. В пробирку с плазмой крови кролика вносят исследуемую культуру и инкубируют в течение суток при температуре 36ОС. При положительной реакции на плазмокоагулазу образуется плотный сгусток. Для выявления фибринолитической активности пробирку со сгустком оставляют в термостате еще на сутки. При наличии фибринолизина сгусток разжижается (рисунок 1.12). В последние годы в материале от больных со стафилококковой инфекцией все чаще обнаруживают коагулазоотрицательные стафилококки, считавшиеся ранее непатогенными бактериями.
Рисунок 1.12 – Свертывание плазмы крови коагулазой (верхняя пробирка) и разжижение сгустка фибринолизином (нижняя пробирка). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Стафилококки продуцируют каталазу (каталазоположительные), что отличает их от стрептококков и энтерококков, которые являются каталазоотрицательными бактериями. Каталаза разрушает перекись водорода, в результате чего стафилококки защищены от высокотоксичных производных кислорода. Продуцирование каталазы выявляется при добавлении к микробной культуре (на плотной питательной среде или на стекле) 1% раствора перекиси водорода. Положительная реакция проявляется выделением пузырьков газа
(рисунок 1.13).
12
а б Рисунок 1.13 – Выявление каталазы стафилококков с помощью перекиси водорода
на питательном агаре (а) и на стекле (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Стафилококки являются оксидазоотрицательными, то есть не продуцируют оксидазу. Например, цитохромоксидазу выявляют путем нанесения капли суточной микробной культуры на фильтровальную бумажку, смоченную специальным
реактивом |
|
|
N-диметил-β- |
фенилендиамина |
|
месте нанесения |
|
культуры |
Тест на цитохромоксидазу |
выпускаются |
|
Цитохромоксидаза |
|
||
• |
|
1.14). |
|
специальные |
катализирует |
|
|
|
|
|
|
|
восстановительно- |
|
|
|
окислительную реакцию - |
|
|
|
окисляются молекулы |
|
|
|
цитохрома с, |
|
|
|
восстанавливается кислород. |
|
|
• |
Цитохромоксидазу |
|
|
|
обнаруживают смачиванием |
|
|
|
бумажки специальным |
|
|
|
реактивом (1% спиртовый |
|
|
|
раствор α-нафтола; 1% водный |
|
|
|
раствор N-диметил-β- |
б |
|
|
а |
|
фенилендиамина
Рисунок 1.14 – Тест на оксидазу с использованием индикаторных полосок (а) и
дигидрохлорида). Нанесение на
слайдов (б). Синее окрашивание указывает на положительный результат.
бумажку капли суточной
культуры бактерийЗаимствованоприводитиз Интернетк -ресурсов. 9
появлению синего |
|
|
окрашивания. Используют |
|
защищающие |
Стафилококки синтезируют каротиноидные пигменты, |
||
также специальные слайды. |
Пигменты определяют |
цвет колоний |
микробные клетки от оксидантов. |
||
стафилококков на МПА. |
|
|
Синтез ДНКазы характерен для золотистого стафилококка. ДНКаза катализирует расщепление ДНК. Для ее выявления используют агар, содержащий водный раствор ДНК и раствор кальция хлорида. После выращивания культуры на чашку наносят раствор соляной кислоты. Положительная реакция проявляется прозрачной зоной деполимеризованной ДНК вокруг колоний на мутном фоне, образующемся в результате взаимодействия ДНК с соляной кислотой (рисунок
1.15).
13
а б Рисунок 1.15 – Выявление ДНКазы стафилококков: а – положительная реакция, б –
отрицательная реакция. Стрелкой показана зона деполимеризованной ДНК. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Сапрофитный и эпидермальный стафилококки продуцируют уреазу, которая расщепляет мочевину до аммония. Для определения уреазы культуру высевают в бульон с мочевиной. Изменение окраски среды на розовый свидетельствует о присутствии уреазы (рисунок 1.16).
Рисунок 1.16 – Тест на уреазу. Стрелкой показана положительная проба. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
В таблице 1.2 представлены дифференциальные признаки основных видов стафилококков, имеющих медицинское значение.
Таблица 1.2 – Дифференциальные признаки основных видов стафилококков
Признак |
S. aureus |
S. epidermidis |
S. saprophyticus |
Способность к росту в |
+ |
+ |
+/- |
анаэробных условиях |
|
|
|
Рост на среде с 10% натрия |
+ |
+/- |
+ |
хлорида |
|
|
|
Рост при: |
|
|
|
15ОС |
+ |
- |
+ |
45ОС |
+ |
+ |
+/- |
14
Ферментация углеводов до |
|
|
|
кислоты в аэробных условиях: |
|
|
|
- арабиноза |
- |
- |
- |
- галактоза |
+ |
+/- |
- |
- ксилит |
- |
- |
+/- |
- ксилоза |
- |
- |
- |
- лактоза |
+ |
+/- |
+/- |
- маннит |
+ |
- |
+/- |
- манноза |
+ |
+/- |
- |
- раффиноза |
- |
- |
- |
- сахароза |
+ |
+ |
+ |
- трегалоза |
+ |
- |
+ |
- фруктоза |
+ |
+ |
+ |
Щелочная фосфатаза |
+ |
+ |
- |
Гиалуронидаза |
+ |
+/- |
? |
Уреаза |
+/- |
+ |
+ |
Плазмокоагулаза |
+ |
- |
- |
Фибринолизин |
+/- |
+/- |
? |
Гемолитическая активность |
+ |
- |
- |
ДНКаза |
+ |
- |
- |
Чувствительность к новобиоцину |
+ |
+ |
- |
Примечание: “+” - признак выражен; “+/-“ - признак наблюдается непостоянно; “-“ - признак отсутствует; “?” – признак сомнительный.
Антигенными свойствами обладают пептидогликан, тейхоевые кислоты, белок А клеточной стенки, капсула стафилококков. Видоспецифическими антигенами для стафилококков являются тейхоевые кислоты: для S. aureus – рибитолтейхоевые, для S. epidermidis – глицеринтейхоевые, для S. saprophyticus – оба типа тейхоевых кислот.
Резистентность стафилококков. Во внешней среде стафилококки достаточно устойчивы. В пыли они сохраняются до 100 суток, в гное – до 200 суток. Прямой солнечный свет убивает их за 10-12 часов. При температуре 70-80ОС стафилококки погибают через 20-30 минут, при 150ОС – через 10 минут.
Стафилококки устойчивы к высоким концентрациям хлорида натрия (растут на средах в присутствии 10-15% хлорида натрия). Галофильность стафилококков способствует тому, что соленые пищевые продукты и концентраты могут быть контаминированы золотистым стафилококком, способным вызывать пищевые отравления.
К большинству дезинфектантов стафилококки чувствительны. Они также чувствительны к анилиновым красителям (фуксину, кристаллическому фиолетовому, бриллиантовому зеленому) и йоду, что позволяет использовать эти препараты местно для лечения стафилококковых пиодермий. Фуксин и бриллиантовый зеленый входят также в состав селективных сред для выделения энтеробактерий (среды Эндо, Плоскирева) в качестве факторов, подавляющих рост грамположительных бактерий, в том числе стафилококков.
15
Стафилококки не обладают природной устойчивостью к антибиотикам. Однако в настоящее время широкое распространение получили штаммы стафилококков, обладающие множественной устойчивостью к антибиотикам (β- лактамам, эритромицину, тетрациклинам, хлорамфениколу и др.). Устойчивость к антибиотикам чаще всего детерминируется генами, расположенными на бактериальной хромосоме (результат мутаций) или R-плазмидах (результат генетического переноса). Особое внимание уделяется метициллин-резистентным стафилококкам (MRS-штаммам), регистрируемым как при внутрибольничных вспышках, так и при внебольничных инфекциях. Среди метициллин-резистентных стафилококков чаще всего выявляются штаммы золотистого (MRSA) и эпидермального (MRSE) стафилококков. Резистентность стафилококков к β- лактамным антибиотикам обусловлена присутствием mec А гена, который кодирует пенициллин-связывающий белок (ПСБ) 2а. Ген mec А располагается на мобильном генетическом элементе (стафилококковой хромосомной кассете – SCCmec). Расположение некоторых генов на хромосоме уникального штамма (устойчивого к антибиотикам) и хромосоме чувствительных штаммов золотистого стафилококка представлено на рисунке 1.17.
SCC элемент Интегрированная плазмида Профаг Транспозон
Генетические острова уникального штамма Генетические острова других штаммов
Рисунок 1.17 – Хромосомные карты разных штаммов золотистого стафилококка. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Метициллин-резистентный золотистый стафилококк устойчив ко всем β- лактамным антибиотикам (пенициллинам, цефалоспоринам, монобактамам, карбапенемам). По микробиологическим и эпидемиологическим признакам различают внутрибольничные (нозокомиальные) и внебольничные MRSA. Нозокомиальный метициллин-резистентный S. aureus (healthcare-associated MRSA – HA-MRSA) выделяется от пациентов отделений интенсивной терапии. Внебольничный метициллин-резистентный S. aureus (community-associated MRSAS
– CA-MRSA) распространен за пределами лечебных учреждений. Особенностью
16
внебольничных штаммов MRSA является наличие гена, детерминирующего синтез лейкоцидина Пантона-Валентина.
Факторы патогенности стафилококков. В настоящее время у стафилококков выявлено большое количество факторов, участвующих в проявлении патогенных свойств возбудителя. Среди факторов патогенности стафилококков выделяют как структурные компоненты клеток (капсула, белки клеточной стенки), так и секретируемые во внешнюю среду субстанции (экзотоксины, экзоферменты). Каждый фактор патогенности выполняет специфическую функцию. Разные виды стафилококков обладают разным набором факторов патогенности. Основные факторы патогенности стафилококков представлены в таблице 1.3 и на рисунке 1.18.
Таблица 1.3 – Факторы патогенности стафилококков
Название факторов |
Выполняемая функция |
1. Факторы клеточной поверхности
1.1. Микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные матриксные молекулы (MSCRAMM)
Стафилококковый протеин А (SpA) |
Связывание с IgG, препятствие |
|
опсонизации и фагоцитозу |
Фибронектин-связывающие белки |
Связывание бактерий с фибронектином |
(FnbpA и FnbpB) |
|
Коллаген-связывающий белок |
Связывание микробных клеток с |
|
коллагеном |
Белковые клампинг-факторы (ClfA и |
Фактор слипания, участвующий в |
ClfB), хлопьеобразующие факторы |
формировании “псевдокапсулы” |
Эластин-связывающий белок |
Связывание с эластином |
Тейхоевые кислоты |
Адгезия к эпителиальным клеткам |
1.2. Полисахаридная капсула |
Препятствие фагоцитозу, колонизация и |
|
персистенция на слизистой оболочке |
1.3. Стафилоксантин (каротиноидный |
Резистентность к фагоцитозу |
пигмент) |
|
2. Секретируемые факторы |
|
2.1. Токсины |
|
Стафилококковые энтеротоксины (SE A, |
Активация ферментных систем |
B, C, D, E) |
энтероцитов |
Токсин синдрома токсического шока |
Нейротропные и вазотропные эффекты |
(TSSR-1) |
|
Эксфолиативные токсины А и В (ЕТА и |
Разрушение межклеточных контактов в |
ЕТВ) |
эпидермисе |
Цитолитические (порообразующие) |
Индуцированный лизис клеток |
токсины: |
|
1. Цитолизины: |
|
- альфа-гемолизин |
|
- бета-гемолизин (сфингомиелиназа) |
|
- гамма-гемолизин |
|
- дельта-гемолизин |
|
17
2. Лейкоцидин Пантона-Валентина
(PVL)
2.2. Внеклеточные ферменты
Плазмокоагулаза |
Свертывание плазмы крови |
Лецитиназа (лецитовиттелаза) |
Гидролиз липидов, липопротеинов |
Протеазы: |
Расщепление белковых продуктов, |
- цистеиновая (стафопаин) |
распространение бактерий по организму |
- металлопротеаза (ауреолизин) |
|
Гиалуронидаза |
Деградация гиалуроновой кислоты |
Нейраминидаза |
Деградация нейраминовой кислоты |
Стафилокиназа (SAK) |
Активация плазминогена, инактивация |
|
антимикробных пептидов |
ДНКаза |
Разрушение ДНК |
3. Медиаторы межмикробного взаимодействия |
|
Бактериоцины (стафилококкцины) |
Подавляют рост непатогенных |
|
стафилококков, заселяющих биотоп в |
|
норме |
Бактериолизины |
Разрушают пептидогликан клеточной |
|
стенки грамположительных бактерий |
Феромоны |
Сигнальные белковые молекулы, |
|
регулирующие плотность популяции |
|
(кворум-сенсинг) |
Бета-лактамаза |
Разрыв бета-лактамного кольца, |
|
инактивирование бета-лактамных |
|
антибиотиков |
4. Прочие факторы патогенности |
|
Стафилококковый ингибитор |
Ингибирование системы комплемента |
комплемента (SCIN) |
|
Протеин S. aureus, ингибирующий |
Ингибирование хемотаксиса |
хемотаксис (CHIPS) |
нейтрофилов |
Устойчивость к солям и жирным |
Размножение в потовых и сальных |
кислотам. |
железах |
Внеклеточные полисахариды |
Образование экзополисахаридной |
|
матрицы на слизистых оболочках или на |
|
плотных поверхностях (формирование |
|
биопленок) |
Факторы патогенности золотистого стафилококка детерминируются не только хромосомными генами, но и генами интегрированных профагов (9NM1, 9NM2, 9NM3, 9NM4) и автономных плазмид. Гены, определяющие патогенность стафилококков, сгруппированы в острова патогенности. Наиболее полный набор представленных факторов патогенности встречается у штаммов золотистого стафилококка. Штаммы других видов стафилококков могут иметь лишь некоторые факторы патогенности.
18
Капсула Клеточная стенка
Цитоплазматическая мембрана
MSCRAMM |
Токсины |
|
Экзоферменты
Рисунок 1.18 – Факторы патогенности стафилококков.
Факторы патогенности стафилококков по выполняемой функции можно подразделить на следующие группы:
1.Факторы, обеспечивающие адгезию стафилококков (клампинг-фактор, тейхоевые кислоты, капсула и др.).
2.Факторы, способствующие распространению стафилококков по тканям организма (гиалуронидаза, устойчивость к жирным кислотам).
3.Факторы с токсической функцией (токсины).
4.Факторы, препятствующие фагоцитозу (полисахаридная капсула, белок А).
5.Факторы, инактивирующие защитные системы организма (факторы с антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной, антикарнозиновой, антилактоферриновой, антигемоглобиновой активностями).
Микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные матриксные молекулы (MSCRAMM), или адгезины взаимодействуют с различными рецепторами клеток макроорганизма (муцином слизистых оболочек, протеогликанами соединительной ткани и эндотелиоцитов), белками внеклеточного матрикса (коллагеном, фибронектином, ламинином и др.), сывороточными белками (фибриногеном и др.).
Фибронектин-связывающие белки. Фибронектин присутствует в организме в виде фибриллярной сети на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе. Фибронектин-связывающие белки стафилококков способствуют как
адгезии бактерий на поверхности |
клеток, так и распространению их во |
внеклеточном пространстве. |
|
Коллаген-связывающий белок |
экспрессируется некоторыми штаммами |
золотистого стафилококка, выступает фактором адгезии и играет важную роль в патогенезе остеомиелита и септического артрита.
Белок А стафилококков располагается поверхностно, связан с пептидогликаном клеточной стенки бактерий, термолабилен, не разрушается трипсином. Белок А способен связываться с Fс-фрагментом IgG, образующийся при
19
этом комплекс блокирует опсонизирующую активность антител и предотвращает поглощение бактерий фагоцитами (рисунок 1.19).
|
Способ связывания IgG |
Связывание молекулы IgG |
с бактериальной клеткой |
|
|
с белком А через Fc-фрагмент |
для ее опсонизации |
|
|
(препятствие фагоцитозу) |
(помощь фагоцитозу) |
|
Белок А
Клеточная стенка
Рисунок 1.19 – Схема антифагоцитарного действия белка А стафилококка.
Клампинг-факторы стафилококков (хлопьеобразующие факторы ClfA и ClfB) представляют собой фибриноген-связывающие белки клеточной стенки. Наличие этих факторов приводит к склеиванию стафилококков в виде хлопьев при контакте микробных клеток с плазмой крови (рисунок 1.20).
Фибриноген
S. aureus |
S. aureus |
|
ClfB
ClfA
Рисунок 1.20 – Склеивание стафилококков с участием клампинг-факторов.
Внешне этот феномен напоминает реакцию агглютинации, поэтому некоторые авторы называют его реакцией плазмоагглютинации. В результате превращения фибриногена в фибрин вокруг микробных клеток при участии клампинг-фактора формируется псевдокапсула, защищающая бактерии от фагоцитирующих клеток хозяина (рисунок 1.21).
20
Макрофаги организма
Стафилококк с клампинг-фактором
Фибриноген Фибрин
Формирование
псевдокапсулы
Рисунок 1.21 – Формирование псевдокапсулы под влиянием клампинг-фактора стафилококка.
Эластин-связывающий белок принимает участие в бактериальной колонизации тканей, богатых эластином (легкие, кожа, стенки кровеносных сосудов).
Капсула стафилококков препятствует фагоцитозу (защита бактерий от опсонизации комплементом и соответственно комплемент-опосредованного поглощения фагоцитами), но способствует адгезии бактерий к клеткам организма и распространению патогенов по тканям. Микрокапсула обнаруживается у 70% штаммов стафилококков. Роль капсулы в фагоцитозе бактерий отражена на рисунке
1.22.
Фагоцитоз
Опсонизация
Комплемент
Бактерия
Отсутствие Капсульная фагоцитоза
бактерия
Комплемент
Рисунок 1.22 – Роль бактериальной капсулы в комплемент-опосредованном фагоцитозе.
Энтеротоксины стафилококков обусловливают пищевые отравления. Энтеротоксины А, В, С1, С2, С3, D, Е, F являются термостабильными низкомолекулярными белками. Они устойчивы к действию спирта, формалина, протеолитических ферментов. Энтеротоксины взаимодействуют с эпителиальными