Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

3024

.pdf
Скачиваний:
3
Добавлен:
08.01.2021
Размер:
462.4 Кб
Скачать

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Воронежский государственный лесотехнический университет им. Г.Ф. Морозова

Промышленная биотехнология

Методические указания для самостоятельной работы студентов

по направлению подготовки 19.03.01 – Биотехнология

Воронеж 2017

Брындина Л. В.

Промышленная биотехнология: методические указания для самостоятельной работы студентов по направлению подготовки 19.03.01 – Биотехнология [Текст] / Брындина Л.В.; М-во образования и науки РФ, ФГБОУ ВПО «ВГЛТУ им. Г.Ф. Морозова», – Воронеж, 2017. – 40 с.

Цель курса «Промышленная биотехнология» – ознакомить студентов с основными этапами биотехнологических производств, включая:

-виды сырья;

-биообъекты – клетки и ферменты, биохимическая активность которых является основой биопроизводств;

-процессы, лежащие в основе этих производств;

-выделение, очистка и товарные формы конечных продуктов;

-показать уникальные возможности микроорганизмов и разнообразие ферментативных реакций, лежащих в основе биопроизводств;

-дать характеристику сырья, в том числе, недефицитных вторичных продуктов и отходов ряда производств;

-ознакомить с методами культивирования микроорганизмов;

-дать характеристику этапам получения конечных продуктов биотехнологических производств.

Самостоятельная работа студентов предусматривает детальную проработку отдельных вопросов по некоторым разделам дисциплины. Такая работа дает возможность студентам получить навыки работы с конспектом лекций, рекомендуемой литературой, а также анализировать полученные данные. Базовой основой теории являются лекции. На лекциях студенты должны обязательно записывать название темы и план лекции, которые даются преподавателем. Согласно плану рассматриваются отдельные вопросы, как теоретические, так и выносимые на лабораторные занятия. Следует фиксировать основные положения, отмечать не вполне ясный материал, чтобы поднять эти вопросы при обсуждении. Кроме того, студентам на лекциях следует обратить внимание на источники получения информации; они даются при изучении темы в виде методических учебных пособий, научных разработок, пособий, имеющихся в библиотеке и на кафедре. В конце лекций следует записывать вопросы, выносимые на обсуждение.

Тема 1. Основы биотехнологического производства.

Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших промышленное применение, приводит к необходимости рассмотреть общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехнологического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют на 2 большие группы: производство биомассы и получение продуктов метаболизма. Однако такая классификация не отражает наиболее существенных с технологической точки зрения аспектов промышленных биотехнологических процессов. В этом плане необходимо рассматривать стадии биотехнологического производства, их сходство и различие в зависимости от конечной цели биотехнологического процесса.

Существует 5 стадий биотехнологического производства. Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.

Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.

На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.

Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными.

Вопросы для самоконтроля

1.Какова технология приготовления питательных сред для биосинтеза?

2.Охарактеризуйте стадию получения засевной дозы.

3.Что представляет собой ферментация? Дайте описание устройства ферментера.

4.Охарактеризуйте общие принципы разделения веществ.

5.В каком случае применяются методы тонкой очистки веществ?

6.Что представляет собой стадия получения готовых товарных форм препаратов?

Тема 2. Биотехнологические производства, основанные на получении микробной биомассы

По данным ряда специалистов мировой дефицит белка к началу XXI в. оценивается в 30—35 млн. т. Основным путем снижения и ликвидации этого дефицита является производство биомассы с помощью микробного синтеза, имеющее следующие преимущества перед другими источниками белковых веществ: микроорганизмы обладают высокой скоростью накопления биомассы, которая в 500—5000 раз выше, чем у растений или животных; микробные клетки способны накапливать очень большое количество белка (дрожжи — до 60%, бактерии — до 75% по массе); в микробиологическом производстве за счет высокой специфичности микроорганизмов отсутствует многостадийность; сам процесс биосинтеза протекает в мягких условиях при температуре 30—45°С, рН 3—6 и давлении ~0,1 МПа, он менее трудоемок по сравнению с получением сельскохозяйственной продукции и органическим синтезом белков.

Все эти преимущества и предопределили быстрое развитие технологии получения микробного белка, которое является самой крупнотоннажной отраслью биотехнологии и открывает возможность промышленного производства с помощью микроорганизмов важнейших кормовых добавок для животноводства и птицеводства с высокой кормовой ценностью и в необходимом количестве.

Белки являются обязательными компонентами клеток любого живого организма, выполняющими жизненно важные функции: каталитические регуляторные, транспортные, биоэнергетические, защитные от инфекции и действия стрессовых факторов; структурные, запасные и др. В вегетативной массе растений на долю белков приходится 5—15 % сухого вещества, в зерне злаков — 8—18%, семенах масличных растений16—28 %, зерне зернобобовых культур — 20—40 %. В различных тканях организма человека и животных содержание белков обычно от 20 до 80 % их сухой массы.

Исходя из этого совершенно очевидно, что для образования клеток и тканей организма, а также поддержания его жизненных функций должен осуществляться постоянный синтез структурных и других форм белков. Для синтеза белковых молекул все живые организмы используют 18 ами-

нокислот и два амида (аспарагин и глутамин). Однако после синтеза белков их молекулы могут подвергаться модификациям, вследствие чего в составе белков обнаруживают до 26 аминокислот.

Растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать все входящие в их состав аминокислоты из простых веществ — углекислоты, воды и минеральных солей, тогда как в организме человека и животных некоторые аминокислоты не могут синтезироваться и должны поступать в организм в готовом виде как компоненты пищи. Такие аминокислоты принято называть незаменимыми, к ним относятся валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Отсутствие в пище хотя бы одной незаменимой аминокислоты привод к тяжелым заболеваниям человека, а недостаток их в кормах снижает продуктивность сельскохозяйственных животных.

Кормовые и пищевые белки, имеющие оптимальное содержание незаменимых аминокислот, называют биологически полноценными

белками.

Всоответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей от 60 до 120 г полноценного белка. Для правильного кормления сельскохозяйственных животных необходимо, чтобы в их кормовом рационе в расчете на каждую кормовую единицу содержалось 100—120 г хорошо перевариваемого и полноценного белка.

Врезультате изучения различных организмов было выяснено, что высокой интенсивностью синтеза белков отличаются многие микроорганизмы, причем белки микробных клеток имеют повышенное содержание незаменимых аминокислот.

Микроорганизмы в качестве источников кормового белка имеют ряд преимуществ по сравнению с растительными и даже животными организмами. Они отличаются высоким (до 60 % сухой массы) и устойчивым содержанием белков, тогда как в растениях концентрация белковых веществ значительно варьирует в зависимости от условий выращивания, климата, погоды, типа почвы, агротехники и др. Наряду с белками в микробных клетках образуются и другие ценные в питательном отношении вещества: легкоусвояемые углеводы, липиды с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот, витамины, макро- и микроэлементы.

Микроорганизмы имеют еще одно ценное преимущество — способность очень быстро наращивать белковую массу. Например, растения сои массой 500 кг в фазе созревания семян способны в сутки синтезировать 40 кг белков, бык такой же массы — 0,5—1,5 кг, а дрожжевые клетки массой 500 кг —до 1,5 т белков. В качестве источников кормового белка наиболее часто используются различные виды дрожжей и бактерий, микроскопические грибы, одноклеточные водоросли, белковые коагуляты травянистых растений.

Производство микробной биомассы - самое крупное микробиологическое

производство. Микробная биомасса может быть хорошей белковой добавкой

для домашних животных, птиц и рыб. Производство микробной биомассы особенно важно для стран, не культивирующих в больших масштабах сою (соевую муку используют как традиционную белковую добавку к кормам).

При выборе микроорганизма учитывают удельную скорость роста и выход биомассы на данном субстрате, стабильность при поточном культивировании, величину клеток. Клетки дрожжей крупнее, чем бактерий,

илегче отделяются от жидкости при центрифугировании. Можно выращивать полиплоидные мутанты дрожжей с крупными клетками. В настоящее время известны только две группы микроорганизмов, которым присущи свойства, необходимые для крупномасштабного промышленного производства: это дрожжи рода Candida на n-алканах (нормальных углеводородах) и бактерии Methylophillus methylotrophus на метаноле.

Микроорганизмы можно выращивать и на других питательных средах: на газах, нефти, отходах угольной, химической, пищевой, винно-водочной, деревообрабатывающей промышленности. Экономические преимущества их использования очевидны. Так, килограмм переработанной микроорганизмами нефти дает килограмм белка, а, скажем, килограмм сахара - всего 500 граммов белка. Аминокислотный состав белка дрожжей практически не отличается от такового, полученного из микроорганизмов, выращенных на обычных углеводных средах. Биологические испытания препаратов из дрожжей, выращенных на углеводородах, которые проведены

иу нас в стране и за рубежом, выявили полное отсутствие у них какого-либо вредного влияния на организм испытуемых животных. Опыты были проведены на многих поколениях десятков тысяч лабораторных и сельскохозяйственных животных. В непереработанном виде дрожжи содержат неспецифические липиды и аминокислоты, биогенные амины, полисахариды и нуклеиновые кислоты, а их влияние на организм пока еще плохо изучено. Поэтому и предлагается выделять из дрожжей белок в химически чистом виде. Освобождение его от нуклеиновых кислот также уже стало несложным.

Всовременных биотехнологических процессах, основанных на использовании микроорганизмов, продуцентами белка служат дрожжи, другие грибы, бактерии и микроскопические водоросли.

С технологической точки зрения наилучшими из них являются дрожжи. Их преимущество заключается прежде всего в "технологичности": дрожжи легко выращивать в условиях производства. Они характеризуются высокой скоростью роста, устойчивостью к посторонней микрофлоре, способны усваивать любые источники питания, легко отделяются, не загрязняют воздух спорами. Клетки дрожжей содержат до 25% сухих веществ. Наиболее ценный компонент дрожжевой биомассы - белок, который по составу аминокислот превосходит белок зерна злаковых культур и лишь немного уступает белкам молока и рыбной муки. Биологическая ценность дрожжевого белка определяется наличием значительного количества незаменимых аминокислот. По содержанию витаминов дрожжи превосходят все белковые корма, в том числе и рыбную муку. Кроме того, дрожжевые

клетки содержат микроэлементы и значительное количество жира, в котором преобладают ненасыщенные жирные кислоты. При скармливании кормовых дрожжей коровам повышаются удои и содержание жира в молоке, а у пушных зверей улучшается качество меха. Интерес представляют и дрожжи, обладающие гидролитическими ферментами и способные расти на полисахаридах без их предварительного гидролиза. Использование таких дрожжей позволит избежать дорогостоящую стадию гидролиза полисахаридсодержащих отходов. Известно более 100 видов дрожжей, которые хорошо растут на крахмале как на единственном источнике углерода. Среди них особенно выделяются два вида, которые образуют как глюкоамилазы, так и β-амилазы, растут на крахмале с высоким экономическим коэффициентом и могут не только ассимилировать, но и сбраживать крахмал: Schwanniomyces occidentalis и Saccharomycopsis fibuliger. Оба вида - перспективные продуценты белка и амилолитических ферментов на крахмалсодержащих отходах. Ведутся поиски и таких дрожжей, которые могли бы расщеплять нативную целлюлозу. Целлюлазы обнаружены у нескольких видов, например у Trichosporon pullulans, однако активность этих ферментов низкая и о промышленном использовании таких дрожжей говорить пока не приходится. Дрожжи из рода Kluyveromyces хорошо растут на инулине - основном запасном веществе в клубнях топинамбура - важной кормовой культуры, которая также может быть использована для получения дрожжевого белка.

В последнее время в качестве продуцентов белка стали использовать бактерии, которые отличаются высокой скоростью роста и содержат в биомассе до 80% белка. Бактерии хорошо поддаются селекции, что позволяет получать высокопродуктивные штаммы. Их недостатками являются трудная осаждаемость, обусловленная малыми размерами клеток, значительная чувствительность к фаговым инфекциям и высокое содержание в биомассе нуклеиновых кислот. Последнее обстоятельство неблагоприятно только в том случае, если предусматривается пищевое использование продукта. Снижать содержание нуклеиновых кислот в биомассе, употребляемой на корм животным, нет необходимости, так как мочевая кислота и ее соли, образующиеся при разрушении азотистых оснований, превращаются в организме животных в алантоин, который легко выделяется с мочой. У человека избыток солей мочевой кислоты может способствовать развитию ряда заболеваний.

Следующую группу продуцентов белка составляют грибы. Они привлекают внимание исследователей благодаря способности утилизировать самое разнообразное по составу органическое сырье: мелассу, молочную сыворотку, сок растений и корнеплодов, лигнин- и целлюлозосодержащие твердые отходы пищевой, деревообрабатывающей, гидролизной промышленности. Грибной мицелий богат белковыми веществами, которые по содержанию незаменимых аминокислот ближе всего к белкам сои. Вместе с тем белок грибов богат лизином, основной аминокислотой, недостающей в белке зерновых культур. Это позволяет на основе зерна и грибной биомассы

составлять сбалансированные пищевые и кормовые смеси. Грибные белки имеют достаточно высокую биологическую ценность и хорошо усваиваются организмом.

Положительным фактором является и волокнистое строение выращенной культуры. Это позволяет имитировать текстуру мяса, а с помощью различных добавок - его цвет и запах. Хранят грибной мицелий обычно в замороженном виде.

В качестве субстрата грибами используются глюкоза и другие питательные вещества, а общим источником азота служат аммиак и аммонийные соли. После завершения стадии ферментации культуру подвергают термообработке для уменьшения содержания рибонуклеиновой кислоты, а затем отделяют мицелий методом вакуумного фильтрования.

Источниками белковых веществ могут служить и водоросли. При фототрофном способе питания и образования биомассы они используют углекислый газ атмосферы. Выращивают водоросли, как правило, в поверхностном слое прудов, где с площади 0,1 га можно получить столько же белка, сколько с 14 га посевов фасоли. Белок водорослей пригоден не только для кормовых, но и пищевых целей.

Наконец, хорошими продуцентами белка являются рясковые, которые накапливают протеина до 45% от сухой массы, а также до 45% углеводов. Однако, несмотря на свои малые размеры, они не принадлежат к вышеперечисленным производителям белка (микроорганизмам), так как не только являются многоклеточными организмами, но и относятся к высшим растениям.

Вопросы для самоконтроля

1.Какие микроорганизмы могут использоваться для производства микробной биомассы?

2.Что представляет собой биомасса?

3.Перечислите основные этапы синтеза микробной биомассы.

Тема 3. Технология биосинтеза аминокислот, органических кислот, витаминов

Производство аминокислот относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получили широкое применение в парфюмерной и фармацевтической промышленности, в пищевой – в качестве усилителей вкуса (глицин добавляют как подсластитель, натриевая соль глутаминовой кислоты имеет мясной вкус), они используются как пищевые добавки для обогащения растительных белков (лизин, треонин, триптофан).

В настоящее время аминокислоты получают методами:

биологическим (применение гидролиза белоксодержащих субстратов);

химическим (тонкий органический синтез);

химико-энзиматическим (энзиматическая трансформация химически синтезированных предшественников аминокислот с образованием биологически активных L-изомеров);

микробиологическим (получение L-аминокислот).

Древнейший способ получения аминокислот — кислотный, щелочной или ферментативный гидролиз белоксодержащих субстратов (мясо, молоко и т.д.). При высокой температуре белок расщепляется на соответствующие аминокислоты или фрагменты, состоящие из нескольких аминокислот. При этом образуется смесь аминокислот и пептидов. Извлечение из этой смеси какой-либо определенной аминокислоты — довольно сложная, но, тем не менее выполнимая задача. Само по себе сырье (мясо и белок молока — казеин) — дорогостоящий продукт, и этот метод применяется, когда имеют дело с «бросовым» сырьем, т.е. с отходами производства (таким сырьем являются рога, копыта, волосы, перья и пух, состоящие из кератина, в котором содержится очень много серосодержащей кислоты цистеина, и – в небольших количествах — других аминокислот).

Следующий способ получения чистых аминокислот – химический синтез. Их синтезируют подобно другим органическим кислотам, это не сложно. Однако в процессе химического синтеза получается смесь D- и L- стереоизомеров (иногда получается и большее количество изомеров), а как известно, в белках человека биологически активны только L-стереоизомеры аминокислот, поэтому существуют трудности разделения этих изомеров. Кроме того, химическое производство аминокислот, как правило, связано с использованием дорогостоящего оборудования и нередко агрессивных токсических соединений в качестве исходного сырья. Процесс протекает при высокой температуре, требует дорогостоящих катализаторов и как всякое химическое производство сопровождается образованием побочных продуктов, загрязняет окружающую среду, небезопасно и небезвредно для обслуживающего персонала.

Тем не менее, некоторые аминокислоты получают химическим синтезом, например глицин, а также D-, L-метионин, D-изомер которого малотоксичен, поэтому медицинский препарат на основе метионина содержит D- и L-формы, хотя за рубежом в медицине используется препарат, содержащий только L-форму метионина. Там рацемическую смесь метионина разделяют биоконверсией D-формы в L-форму под влиянием специальных ферментов живых клеток микроорганизмов.

Следующий способ получения аминокислот — химикоэнзиматический. Как видно из названия, этот метод получения аминокислот предполагает два этапа. Сначала химическим методом синтезируется «предшественник» — соответствующая карбоновая кислота, а затем эта карбоновая кислота (обычно в присутствии аммиака) превращается в соответствующую аминокислоту. Эта биотрансформация (биоконверсия) осуществляется ферментами живых клеток. Причем полученные L- стереоизомеры аминокислот сами по себе необходимы для жизнедеятельности этих клеток, т.е. фактически этот способ наполовину

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]