1795

2

УДК 638.1

Рындин В. Е. Пчеловодство. Методы диагностики бактериозов и мико-

зов пчѐл [Электронный ресурс]: методические указания к практическим за-

нятиям для студентов по направлению подготовки 35.03.01 – Лесное дело,

05.03.06 – Экология и природопользование/ В. Е. Рындин; МОиН РФ,

ФГБОУ ВО «ВГЛТУ». – Воронеж, 2016. – 31 с.

Печатается по решению редакционно-издательского совета ФГБОУ ВО «ВГЛТУ»

Рецензент канд. биол. наук А.И. Масалыкин

3

ВВЕДЕНИЕ Настоящее методическое указание предназначено для студентов ста-

ционарного обучения направления подготовки бакалавра 35.03.01 – «Лесное дело», 05.03.06 – «Экология и природопользование».

В указаниях разбираются наиболее сложные для самостоятельного изучения вопросы пчеловодства – правила работы и диагностирования патологических семей.

Медоносная пчела подвержена различным заболеваниям, многие из которых наносят значительный ущерб пчеловодству, приводя к снижению продуктивности и гибели пчелиных семей.

Успешное развитие пчеловодства немыслимо без знаний патологии медоносных пчѐл. Концентрация семей пчѐл на крупных пасеках, массовые передвижения (кочѐвки) пасек, обмен племенной продукцией, трудности изолирования пчѐл на местности и карантин могут приводить к широкому распространению возбудителей различных болезней среди этих насекомых. Распространению возбудителей способствуют также биологические особенности пчѐл: перелѐты пчѐл и трутней, слѐты роѐв, нападения на слабые семьи. Некоторые возбудители болезней других видов насекомых могут передаваться и пчѐлам. За последнее время установлены новые нозологические единицы: более десяти вирусов, спироплазмы (микоплазмы), заставившие по иному оценить причины возникновения пыльцевого токсикоза. Возникшая панзоотия варрооза вызывает необходимость изучать роль клещей в патологии пчѐл, и здесь тоже выявлен ряд новых заболеваний.

Многие заболевания пчѐл трудно дифференцировать. Механическое отделение расплода от взрослых пчѐл не даѐт целостного представления о роли той или иной группы этиологических агентов в патологи пчѐл.

Профилактика инфекционных заболеваний пчѐл в нашей стране в основном строится на применении лечебных препаратов. Без уничтожения возбудителей эти меры не могут привести к оздоровлению пасек, а только ослабляют заболеваемость и приводят к накоплению в мѐде и других продуктах пчеловодства антибиотиков и сульфаниламидных препаратов, что создаѐт опасность для здоровья людей и пчѐл.

Успех профилактики и лечения заболеваний пчѐл во многом зависит от правильного диагностирования болезни и выявления возбудителя. Профилактика инфекционных и паразитарных болезней зависит от санитарного состояния ульев, сотов, инвентаря, пасечных построек и самой территории точка. Важным этапом противоэпизоотических мероприятий является дезинфекция, эффективность которой зависит от того, насколько полно и своевременно будут обеззаражены все инфицированные объекты на неблагопо-

4

лучной пасеке и, следовательно, разорвана эпизоотическая цепь в звене передачи возбудителя инфекции.

ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ БАКТЕРИОЗОВ

ИМИКОЗОВ ПЧЕЛ

Тема 1 (2 часа)

ПРАВИЛА ОТБОРА И ПЕРЕСЫЛКИ ПАТМАТЕРИАЛА.

Для бактериологического, микроскопического, серологического, биологического, химического и других видов исследований берут пробы патматериала: живых пчел и их трупы; соты с расплодом, медом, пергой; засохшие корочки пчелиных личинок; испражнения или соскобы каловых масс; мазки гемолимфы и отпечатки мышц на предметных стеклах; воскоперговую крошку со дна ульев; насекомых паразитов и вредителей пчел.

Для установления причин заболевания пчел в ветеринарную лабораторию посылают:

а) при гнильцовых болезнях — образцы сотов (сота) размером не менее 10*15 см с больными и погибшими личинками и куколками (в случае гибели незапечатанных личинок образец должен содержать неразложившиеся личинки); при подозрении на мешотчатый расплод образцы сотов с пораженным расплодом консервируют 50 %-ным раствором глицерина;

б) при подозрении на болезни, проявляющиеся септицемией (септицемия, сальмонеллез, гафниоз, колибактериоз) — по 50 живых пчел от каждой больной пчелиной семьи;

в) при подозрении на вирозы и спироплазмоз — по 50 законсервированных в 50%-ном глицерине пчел, проявлявших признаки заболевания;

г) при подозрении на варрооз: зимой — трупы пчел и сор со дна ульев в количестве не менее 200 г с пасеки; весной — пчелиный расплод на соте с нижнего края размером З*15 см и сор со дна улья в указанном выше количестве; летом и осенью — запечатанный расплод (пчелиный и трутневый) в указанном количестве или 50—100 экземпляров живых внутриульевых пчел от 10 % подозреваемых в заболевании пчелосемей пасеки;

5

д) при других болезнях — по 50 живых пчел с признаками или столько же трупов свежего подмора из подозреваемых семей; при обследовании (паспортизации) пасек берут такое же количество пчел от 10 % семей пасеки; е) при подозрении на отравление — 400—500 трупов пчел, 200 г откаченного незапечатанного меда и 50 г перги в соте от 10 % пчелиных семей с характерными признаками поражения, а также 100—200 г зеленой массы

растений с участка, посещаемого пчелами; ж) для обнаружения в меде пади или возбудителей болезней — 100 г,

пестицидов — 200 г меда; воска и вощины — от каждой партии не менее 100 г.

Патологический материал упаковывают и пересылают:

живых пчел в стеклянной банке, которую обвязывают двумя слоями марли или ткани;

образцы сотов с расплодом и сотовые рамки — в фанерном или деревянном ящике без обертывания сотов бумагой, отделяя их друг от друга и от стенок ящика деревянными планками;

больных живых пчел на закрепленных сотовых рамках с кормом в количестве, достаточном на время пересылки, в фанерном или деревянном ящике;

погибших пчел и крошку со дна ульев—в бумажных пакетах; мед — в стеклянной посуде, плотно закрытой крышкой; воск и вощину— в целлофановом пакете.

При консервации материала в глицерине пчел и образцы сотов помещают в чистые стеклянные банки с плотно закрывающейся крышкой и заливают 50 %-ным глицерином; банки обертывают мягкой тканью, помещают в деревянный ящик.

Подмор пчел, зеленую массу для исследования на отравление упаковывают в чистые мешочки из целлофана, полиэтилена, бумаги, материи и помещают вместе с сотами в ящик.

Вредителей и паразитов пчел, имеющих жесткий покров, отправляют в картонной коробке на вате; имеющих мягкий покров — во флаконе с 10 %- ным раствором формалина, 80 %-ном спирте или меде. Картонные коробки или флаконы упаковывают в фанерный или деревянный ящик.

6

Отправляемый патматериал сопровождают письмом ветеринарного специалиста, производившего отбор и упаковку проб. В нем указывают наименование хозяйства (фамилию, имя, отчество владельца пасеки), адрес, номер улья, количество проб, характерные признаки заболевания и цель исследования. При подозрении на отравление прилагают акт или копию акта комиссии, обследовавшей пасеку и отобравшей материал, в сопроводительном письме конкретно указывают, на какой ядохимикат следует провести исследование. Сопроводительное письмо должно иметь штамп ветеринарного учреждения.

Срок доставки проб на исследование в лабораторию не должен превышать 1 суток с момента отбора материала.

Ветеринарная лаборатория регистрирует поступивший материал в соответствующем журнале, а результаты исследований сообщает в хозяйство. При установлении возбудителя болезни определяют чувствительность выделенного микроорганизма к антибиотикам и рекомендуют применение наиболее активного антибиотика. После исследования патматериал сжигают.

Тема 2 (4часа)

ПОРЯДОК ИССЛЕДОВАНИЯ ПАТМАТЕРИАЛА.

Каждый образец патматериала обрабатывают по следующей схеме:

а) наружный (визуальный) осмотр сотов и подмора пчел; б) осмотр и отбор больных личинок и пчел под лупой; в) вскрытие личинок и взрослых пчел; г) микроскопия нативных мазков; д) посевы на питательные среды; е) изучение культурально-биохимических свойств; ж) в сомнительных случаях изучают серологические и патогенные свойства некоторых изолированных культур.

Результаты исследований регистрируют в специальном журнале.

АМЕРИКАНСКИЙ ГНИЛЕЦ. Диагноз на американский гнилец ставят на основании характерных признаков поражения расплода и результатов микроскопических, бактериологических и серологических исследований. Предварительно заключение дают в первый день исследования на основании осмотра сота и обнаружения характерных спор Вас. larvae в мазках из патма-

7

териала. Окончательный диагноз ставят на 3—5 день исследования после получения чистой культуры Вас. larvae.

Для микроскопии готовят тонкие мазки из гнильцовой массы или «корочек» (2—3 штуки), которые предварительно размачивают теплым (35—40 °С) стерильным физраствором в течение 20—30 мин. Его наливают в ячейки, тщательно перемешивают гнильцовую массу вращательными движениями конца пастеровской пипетки. При плохом размачивании в прокрашенных кусочках тканей споры обнаружить трудно. В тягучей гнилостной массе и корочках обнаруживают споры возбудителя, которые хорошо окрашиваются 2 %-ным спиртовым раствором карболового фуксина в течение 1,5—2 мин (по Граму споры не окрашиваются). На искусственных питательных средах спорообразование слабое или отсутствует. Споры овальной формы (1,2—1,8Х

0,6— 0,7 мкм).

При микроскопии мазков (увеличение 900) обнаруживают грамположительные палочки Вас. larvae длиной 1,5—6 мкм и шириной 0,5—0,8 мкм; они располагаются цепочками в виде стрептобацилл.

Для выращивания возбудителя американского гнильца пчел используют следующие среды.

1. Среда Томашеца (или мясо-пептонный сывороточный агар): ее готовят добавлением к расплавленному и охлажденному до 45—50 °С мясопептонному агару (рн 6,8—7,0) 10 % стерильной лошадиной сыворотки. Агар-агар используют только растительный (нельзя брать для этой цели агар с рыбьим гидролизатом, так как на нем Вас. larvae не растет).

2. Мясо-пептонный сывороточный бульон: к обычному (лучше приготовленному из отвара конского мяса) мясо-пептонному бульону (рН 6,8— 7,2) добавляют 10 % стерильной лошадиной сыворотки.

3. Яичный агар и бульон Уайта: свежее яйцо протирают ватным тампоном, смоченным этиловым спиртом, и обжигают на огне, затем стерильно вскрывают; отделяют белок, желток выливают в колбочку с 70 мл стерильной воды и тщательно смешивают. К 5 мл расплавленного и охлажденного (45—50 °С) МПА, или МПБ, в пробирке добавляют стерильно по 1 мл эмульсии желтка и круговыми движениями пробирки между ладонями рук тщательно смешивают агар или бульон с желтком. Перед посевом среды выдерживают двое суток в термостате для определения стерильности.

8

4.Кровяной агар Цейслера: 3 %-ный мясо-пептонный агар (рН 7,2— 7,4), приготовленный из растительного агар-агара, разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 120 °С; по мере необходимости агар в колбе расплавляют в водяной бане, а затем охлаждают до 42—45 °С. К агару добавляют 10 мл 20 %-ного стерильного раствора глюкозы и 15— 20 мл стерильной свежевзятой или дефибринированной крови овцы (лучше лошади). Смесь осторожно перемешивают (избегать образования пены!) и разливают в стерильные чашки. Для подсушивания среды чашки выдерживают

втермостате 4—6 ч. Дефибринированную кровь можно заготавливать впрок (на 10—15 дней), сохраняя еѐ в стерильных условиях по 20—25 мл в колбочках.

5.Кровяная среда Тошкова: к обычному или содержащему желточную эмульсию мясо-пептонному агару или бульону добавляют стерильно 5—10 % дефибринированной крови лошади или овцы.

6.Среда Майкла: дрожжевой экстракт — 10 см3, пептон — 10 г, растительный агар-агар — 15 г, тиамин — 0,1 мг, дистиллированная вода — 1 л, рН — 6,8. Экстракт дрожжей готовят из 100 г измельченных хлебных дрожжей в 1 л водопроводной воды, смесь тщательно перемешивают и кипятят 30 мин, затем отстаивают, фильтруют в горячем состоянии через 3 слоя марли и оставляют до просветления. Экстракт в этот же день употребляют для приготовления среды или добавляют к нему 1 % хлороформа, что позволяет сохранять его в холодильнике до месяца.

Получить чистую культуру Вас. larvae на плотной питательной среде из отдельных клеток возбудителя трудно. Поэтому на поверхность плотной питательной среды необходимо вносить как можно больше гнильцовой массы.

Видимый рост отдельных колоний Вас. larvae на среде Томашеца появляется и заметен невооруженным глазом через 24 ч в виде типичных шероховатых (тип R) колоний размером 1—3 мм в диаметре; они нежные, слегка выпуклые, вначале прозрачные, затем серо-белые. Колонии имеют характерные, отходящие в стороны, отростки в виде «усиков». При сплошном росте на поверхности агара (через 48—72 ч с момента посева) появляются серова- то-белые наложения, имеющие ограниченные локоно-образные края. На мя- со-пептонном сывороточном бульоне они образуют через 24 ч помутнение.

9

Через 48—74 ч на дне пробирки заметен хлопьевидный осадок в виде ваты, легко разбивающийся при встряхивании в равномерную муть.

Наряду с типичными R-формами колоний встречаются и диссоциированные от действия бактериофага и других факторов атипичные RSформы (переходные) с гладкими краями, с единичными нитевидными отростками или колонии S-формы круглые, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью.

При просмотре мазков из атипичных колоний палочки Вас. larvae бывают короткими и толстыми, они утрачивают способность располагаться цепочками, иногда встречаются уродливые формы палочек — извитые, вздутые и др.

Биохимические свойства выделенных штаммов Вас. larvae изучают путем выращивания на обычных питательных средах пестрого ряда, к которым добавляют 10 % стерильной лошадиной сыворотки. Все типичные штаммы Вас. larvae медленно (6—10 дней) расщепляют глюкозу и левулезу с образованием кислоты, но без газа, не сбраживают арабинозу, ксилозу, лактозу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, маннит, дульцит, сорбит, инозит. Не образуют индола, аммиака, сероводорода (отдельные штаммы слабо выделяют сероводород и аммиак). Разжижают желатину, вызывают свертывание и пептонизацию молока, не гидролизуют крахмал, нитраты восстанавливают, не обладают гемолитическими свойствами, каталазный тест — отрицательный.

Серологическую диагностику проводят с помощью реакции преципитации, используя ларвейную преципити-рующую сыворотку или реакцию капельной агглютинации.

Антиген для реакции преципитации готовят из десяти погибших от гнильца личинок, которых помещают в ступку, добавляя десятикратное количество физраствора (15 мл для взрослых и 7 мл для 3—4-дневных личинок), тщательно растирают, суспензию нагревают на кипящей водяной бане 15 мин и фильтруют через асбестовую вату до получения прозрачного экстракта. Антигеном для реакции преципитации может служить и прозрачный фильтрат выросшей культуры, профильтрованной через асбестовую вату. Фильтрат разливают по 0,1—0,2 мл в уленгутовские пробирки и подслаивают такое же количество сыворотки (сыворотки и фильтраты должны быть

10

прозрачными). Реакция преципитации протекает при комнатной температуре в течение 15 мин. При положительной реакции через 0,5—2 мин образуется тонкое, нежное, голубовато-матовое кольцо.

Антигены для реакции агглютинации готовят из 5— 10 свежих трупов личинок или «корочек», которые помещают в фарфоровую ступку и заливают 5—10 мл карболизированного 0,5 %-ного физраствора, измельчают пестиком до получения суспензии и фильтруют через ватный фильтр. Фильтрат центрифугируют 10—15 мин при 1500 об/мин, затем осадок растворяют в 10—15 мл указанного выше физраствора, нагревают на водяной бане до 70 °С и в горячем виде фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат вновь центрифугируют при тех же оборотах, и из осадка готовят антиген в виде густой взвеси микробов и спор (10 млрд/мл).

Реакцию агглютинации ставят на предметном стекле: на один его конец пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей сыворотки, разведенной физраствором (0,1 мл сыворотки + 7,9 мл физраствора), а на другой конец — каплю физраствора. В обе капли вносят такое же количество антигена и хорошо смешивают. При положительном результате в течение 10—20 мин в капле с ларвейной сывороткой жидкость просветляется и наблюдается мелкозернистая агглютинация (появляются белые крупинки). В контрольной капле жидкость остается мутной. Агглютинация в капле с ларвейной сывороткой свидетельствует об американском гнильце.

Фагодиагностику осуществляют с применением ларвейного бактериофага. На поверхность чашки Петри с мясопептонным сывороточным агаром шпателем засевают две капли суточной бульонной культуры и наносят в центр каплю бактериофага. Чашку наклоняют для стока бактериофага, а затем переворачивают ее кверху дном и ставят в термостат на 24—48 ч. В положительном случае на месте протекания капли фага образуется полоса, свободная от роста микробов.

Патогенные свойства устанавливают при заражении пчелиного расплода или кроликов. В стерильные бактериологические чашки, на дне которых уложен слой ваты, покрытой двумя слоями стерильной марли, вносят по 10 мл теплого корма: приготовленного из перги — 50 г, пекарских дрожжей — 5 г, воды водопроводной — 100 мл. Смесь нагревают в водяной бане 45 мин при температуре 100 °С и после охлаждения добавляют равный объем не-