1795

11

прогретого меда. Затем в здоровой пчелиной семье от сота с расплодом срезают острым, слегка подогретым ножом верхнюю часть ячеек и осторожно извлекают 3—4-дневных личинок, которые размещают в бактериологических чашках по 15—20 штук. Через сутки выдерживания в термостате при температуре 35 °С отбирают под контролем лупы здоровые (неповрежденные) личинки и переносят их в заранее подготовленную теплую чашку. Личинок заражают путем скармливания им свежего корма, к которому добавлено 2 млрд. исследуемых микроорганизмов. Ежедневно под лупой отбирают больных личинок и подвергают микроскопическому и бактериологическому исследованиям. Контролем служат незараженные личинки, содержащиеся в тех же условиях.

Для заражения расплода в микроулейках и ульях используют двухмиллиардную взвесь микробов в сахарном сиропе (1 часть воды+2 части сахара) ежедневно в течение 3—5 дней. Для получения инфицированного корма на 5 частей сиропа берут 1 часть культуры. Такой сироп дают 3— 5 дней. Суточное количество этой подкормки для пчел в микроулье — 50 мл, для пчел в стандартном улье — 500 мл. Признаки гнильца появляются через 8—10 дней после заражения. С 3— 5 дня до окончания биопробы пчелам в микроульях нужно давать сахарный сироп. Подкормку наливают в банки, обвязывают их двумя слоями марли и перевертывают вверх дном. В стандартных ульях банки ставят на рамки, в микроульях — в потолочное отверстие.

Для постановки биопробы на кроликах вначале готовят споровую взвесь Вас. larvae из первичного материала. Для получения спор используют пчелиные личинки, погибшие от американского гнильца и высохшие до состояния корочек. Последние извлекают из ячеек сотов стерильным пинцетом, помещают в стерильные фарфоровые ступки, растирают и добавляют стерильный физраствор (1 мл на 1 растертую корочку). Содержимое тщательно перемешивают. Полученную массу фильтруют через вату. Если фильтрат вязкий, к нему добавляют физраствор до исчезновения слизистой консистенции и снова фильтруют через фильтровальную бумагу. После двукратного центрифугирования фильтрата получают в осадке чистые споры Вас. larvae, отмытые от тканей личинки. Концентрацию спор в 1 мл определяют по оптическому стандарту мутности.

12

Заражают кроликов внутривенно споровой взвесью в дозе 5—6 млн. спор в 1 мл (по оптическому стандарту мутности) на одно животное, морских свинок подкожно дозой 3 млн. спор. Гибель кроликов наступает на 5—7 день, свинок—на 8—10-е сут. Из крови больных и из внутренних органов павших животных выделяют возбудителя американского гнильца пчел.

ЕВРОПЕЙСКИЙ ГНИЛЕЦ. Предварительное заключение о результатах исследования на европейский гнилец может быть дано в день поступления патматериала на основании осмотра сота и микроскопии мазков, окончательный — после проведения полного бактериологического исследования, т. е. через 5—7 дней при условии выделения возбудителя болезни.

Для лабораторного исследования из ячеек сотов извлекают стерильным пинцетом не менее 10 свежих трупов личинок, а при их отсутствии — высохшие корочки трупов. Мазки и посевы производят из содержимого кишечника личинки. Корочки трупов предварительно помещают на 15—20 мин в стерильный физраствор. Мазки окрашивают одновременно и по Граму, для окраски спор возбудителя используют 2 %-ный спиртовой раствор карболового фуксина в течение 1,5—2 мин.

При бактериологическом исследовании недавно погибших личинок чаще обнаруживают Streptococcus pluton, в мазках, приготовленных из загнившей массы личинок и их корочек, как правило, находят споры Вас. alvei, иногда Вас. orpheus, а в мазках из тела личинок с кислым запахом — Strept. apis.

Streptococcus pluton имеют форму вытянутых (ланцетовидных) кокков размером 0,5—1,5 мкм. В мазках они располагаются одиночно, чаще попарно, цепочками и в виде характерных скоплений «розетками»; в культуре и тканях образуют капсулу, окружающую несколько кокков, хорошо красящуюся по методу Кленбергера, Томчика и Новелли. Микроб неподвижен, спор не образует. Стрептококки красятся всеми анилиновыми красками и по Граму (неравномерно), иногда с грамположительными встречаются и грамотрицательные кокки.

Из патматериала стрептококк плютон выделяют культивированием посевов при 35 °С на средах Бейли или Черепова в анаэробных условиях, для

13

чего используют анаэростат или обычный эксикатор, который после постановок чашек или пробирок с посевами наполняют углекислотой (5—10% СОа). Последующее культивирование выделенных штаммов этого возбудителя можно производить и в аэробных условиях.

Для культивирования Strept. pluton используют:

1.Среду Бейли: дистиллированная вода—1 л, глюкоза, растворимый крахмал и экстракт дрожжей — по 10 г, калий фосфорнокислый однозамещенный (КНгРО^)—13,6 г, агар-агар растительный — 20 г (рН 6,6). Среду автоклавируют при 116 °С в течение трех дней подряд по 20 мин. Первичный рост возбудителя на этой среде появляется через 4—7 сут, при последующих пересевах — через 24—48 ч.

2.Среду В. Т. Черепова: в 1 л водопроводной воды вносят 300 г очищенных клубней картофеля (обязательно удалить глазки!), варят в течение 15—20 мин (не доводя до полного разваривания клубней), фильтруют через ватно-марлевый фильтр и к 1 л фильтрата добавляют 2 % растительного агар-агара, 3 г пептона. Смесь стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин, затем добавляют 3 % экстракта пекарских дрожжей и 3 % глюкозы, рН 6,8.

Стерилизуют в аппарате Коха 3 дня по 30 мин или в автоклаве при 0,5 атм 3 дня по 15 мин.

3.Для культивирования Strept. pluton можно использовать полужидкий 0,15%-ный картофельный агар, приготовленный аналогично среде Черепова,

стой лишь разницей, что вместо 2 % добавляют 0,15 % растительного агарагара.

На плотных средах Strept. pluton образует мелкие, круглые, выпуклые, зернистые жемчужно-белого цвета непрозрачные колонии диаметром 1—1,6 мм. В печеночном бульоне и полужидком агаре стрептококк растет с образованием помутнения и нежного пристеночного кольца, на дне пробирки через двое суток выпадает белый осадок. Strept. pluton расщепляет глюкозу и фруктозу без образования газа, не расщепляет сахарозу, галактозу, лактозу, малтозу, рафинозу, рамнозу, маннит, сорбит, инозит, а-ксилозу, глицерин и крахмал. Strept. apis располагается в мазках короткими цепочками, размер отдельных кокков 0,7—0,9 мкм, грамположительная, спор не образует, капсулы не имеет; факультативный аэроб, хорошо растет при температуре 37 °С на обычных средах, а также на средах Бейли, Черепова, кровяном агаре

14

Цейслера. Через 24 ч на агаре образуются мелкие, прозрачные, бесцветные колонии или наложения, они легко снимаются петлей и суспензируются в физрастворе. Микроб вызывает помутнение бульона, разжижает МПЖ, молоко свертывает и пептонизирует, индол и сероводород не образует, выделяет следы аммиака, углеводы разлагает с образованием кислоты, крахмал не гидролизует, нитриты не восстанавливает, на кровяном агаре не вызывает гемолиза.

Вас. alvei—спорообразующая палочка длиной 3—4,5, шириной 0,7— 0,9 мкм; по Граму красится положительно, подвижна, перитрих. Споры располагаются центрально, 2,5— 4 мкм в длину и 0,8—1,5 мкм в ширину, иногда образуют ряды в виде частокола. Возбудитель—факультативный аэроб, растет при температуре 37 °С на обычном МПА и МПБ, кровяном агаре Цейслера, через сутки образуя на агаре крупные колонии неправильной формы в виде «оленьих рогов» грязно-желтого цвета. На агаре Цейслера он образует гемолиз типа р, иногда а. Бульон мутнеет равномерно, на 3—5 день на его поверхности образуется бесцветная или сероватая гладкая, нежная не стабильная пленка со слабым пристеночным кольцом. При встряхивании она опадает хлопьями на дно пробирки. Вас. alvei медленно разжижают МПЖ, молоко свертывают и пептони-зируют, образуют индол; обнаруживаются следы аммиака и сероводорода; крахмал не гидролизируют, нитриты не восстанавливают, расщепляют глюкозу, мальтозу, глицерин, лактозу, сахарозу с образованием кислоты, но без газа. Биохимические свойства не постоянны. Старые культуры имеют неприятный запах, особенно сильный при культивировании микроба на кровяном агаре.

Вас. orpheus — спорообразующая подвижная с закругленными концами палочка длиной 2,5—5 мкм и шириной 1—1,2 мкм. Микроб окрашивается всеми анилиновыми красками и грамполо-жительно. Споры хорошо окрашиваются 2 %-ным спиртовым раствором фуксина в течение 2 мин. В мазках вегетативные и споровые формы микроба располагаются поодиночке. Споры овальной формы длиной 1,2—2 мкм и шириной 0,7—1,2 мкм, располагаются сбоку в средней раздутой части бациллы, характерно также наличие с одной стороны споры арфоили лодкообразного параспорального тела. Бацилла орфеус-аэроб, растет на обычных питательных средах (МПА и МПБ) и особенно хорошо на печеночном агаре с нейтральной или слабоще-

15

лочной реакцией при температуре 35—36 °С. Для приготовления печеночного агар-агара берут свежую печень крупного рогатого скота или свиней, разрезают на куски массой 200—250 г, заливают равным количеством водопроводной воды и автоклавируют при 120 °С в течение часа, затем экстракт фильтруют через ватный фильтр. Параллельно готовят смесь: 2 г растительного агар-агара, 1 г пептона, 0,5 г натрия хлорида и 500 мл водопроводной воды, которую стерилизуют текучим паром 30 мин. Затем к печеночному экстракту добавляют равное количество указанной смеси и после охлаждения до 60 °С устанавливают рН 7,0—7,2. После этого печеночный агар-агар разливают по пробиркам или колбам, стерилизуют автоклавированием при 120 °С в течение 30 мин.

На плотной среде колонии появляются через 24 ч после посева, они 2— 3 мм в диаметре, с ровными краями, беловато-серого цвета с голубоватым оттенком и металлическим блеском, к 48 часам образуется пышное сероватобелое наложение. МПБ в начале мутнеет, затем на дне образуется осадок и бульон просветляется. Желатину разжижает медленно, молоко коагулирует с образованием плотного сгустка. Микроб ферментирует глюкозу, мальтозу, маннозу, декстрозу, ксилозу, салицин и маннит с образованием кислоты, но без газа и не ферментирует сахарозу, рамнозу, лактозу, галактозу, арабинозу, дульцит, сорбит, инозит и адонит. Индола и сероводорода не образует, реакция с метилрот отрицательная, реакция Фогес — Проскауэр положительная, нитраты восстанавливает, на кровяном агаре образует гемолиз типа ос.

При проведении серологической диагностики ставят реакцию преципитации (РП). Антигены для этой реакции готовят из 5—10 трупов пораженных личинок, которые отбирают из присланных образцов сотов. Личинок растирают в фарфоровых ступках с 5 мл физраствора, затем переносят в пробирки и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через асбестовую вату (в воронках диаметром 4 см). Прозрачный фильтрат разливают по 0,1—0,2 мл в чистые уленгутовские пробирки и подслаивают такое же количество сыворотки: в первую пробирку — преципитирующую плютоновую, во вторую — преципитирующую альвейную и т. д., в последнюю — нормальную сыворотку лошади (для контроля). Сыворотки так же, как и экстракты, должны быть прозрачными. Мутные сыворотки предварительно фильтруют через асбестовую вату. РП проходит при ком-

16

натной температуре. При положительной реакции на границе сыворотки и антигена в течение 10—20 мин появляется преципитационное кольцо в виде тонкого серо-белого диска. Положительная РП с плютоновой, альвейной или другими специфическими сыворотками свидетельствует о европейском гнильце. В контрольной пробирке с нормальной сывороткой реакция должна быть отрицательной. Реакцию капельной агглютинации ставят с соответствующими сыворотками, аналогично американскому гнильцу.

Лабораторные животные не восприимчивы к европейскому гнильцу. Патогенные свойства возбудителей этого вида гнильца могут быть установлены путем заражения 3—4-дневных личинок, как и при американском гнильце.

ПАРАГНИЛЕЦ. В лабораторию направляют кусочки сотов с пораженным расплодом и куколками. Микроскопические и бактериологические исследования проводят по общепринятым методикам, описанным выше.

Вас. paraalvei—палочка длиной 2,2—5,7 мкм, шириной 0,5—0,8 мкм. В погибших личинках и на питательных средах она образует слегка овальные споры 1,8—2,3 X 0,9— 1,3 мкм. В бульонных культурах подвижна — перитрих, факультативный аэроб, плохо растет на обыкновенных питательных средах (МПА и МПБ); хорошо культивируется на кровяном сахарном агаре Цейслера и среде Томашеца (10 %-ный сывороточный мясо-пептонный агар, рН 5,8—7,0 и мясо-пептонный сывороточный бульон) при температуре 34— 38,5 °С. На поверхности среды образуются шероховатые колонии с синеватым Металлическим оттенком, обладающие ползучим ростом. Спорообразование на среде Томашеца и агаре Цейслера плохое. Все штаммы Вас. paraalvei гидролизуют крахмал; образуют индол; восстанавливают нитриты; разжижают желатину; не ферментируют глюкозу, рафинозу, маннит, салицин, адонит; реакция Фогес — Проскауера отрицательная; зон гемолиза на кровяном агаре не дает, что отличает его от Вас. alvei.

Патогенные свойства возбудителя могут быть установлены - путем заражения открытого расплода по методике, описанной при американском гнильце.

17

ПОРОШКОВИДНЫЙ РАСПЛОД. Для лабораторного исследования в ветеринарную лабораторию посылают образцы сотов от каждой семьи размером 10Х 15 см с пораженными личинками.

Возбудитель—грамположительная палочка размером 1— 1,5 мкм в длину и 0,6—1,2 мкм в ширину, споры эллипсоидной формы (0,8—1,2Х 1,5 мкм), расположены центрально или терминально; факультативный анаэроб.

Для выделения возбудителя в 2—3 ячейки сота, содержащих остатки разложившихся личинок, вносят по одной капле стерильного физраствора. Бактериологической петлей переносят полученную взвесь на МПА в чашке Петри и равномерно распределяют шпателем по его поверхности. Затем посевы инкубируют при 37 °С. Одновременно из взвеси готовят мазки, фиксируют пламенем или раствором спирт-эфира (1:1), окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. Через 2—3 сут инкубирования посевы просматривают. На МПА возбудитель растет в виде колоний светло-оранжевого или светло-коричневого цвета, либо в виде тонкого буроватого налета.

Из каждой чашки по две типичные колонии переносят на скошенный мясо-пептонный агар для получения чистой культуры.

Для изучения морфологии выделенных чистых культур бактерий готовят мазки, фиксируют их, окрашивают по Граму и микроскопируют. Подвижность культур определяют по характеру роста в 0,3 %-ном полужидком МПА. Биохимические свойства культур исследуют на средах с сахарами, желатине, казеине, крахмало-аммиачном агаре, ставят пробу на каталазу. На средах с глюкозой, маннитом, трегалозой они образуют кислоту, разжижают желатину, разлагают казеин, не изменяют крахмал. Тест на каталазу отрицательный.

Лучшее спорообразование происходит в течение 5—7 дней инкубации на МПА с добавлением экстракта пыльцы.

Положительный бактериологический диагноз ставят при выделении культуры Вас. pulvi-faciens.

18

Рис. Pseudomonas apisepticum. Увеличение Х900.

СЕПТИЦЕМИЯ. В лабораторию посылают не менее 10 штук больных пчел. При невозможности доставить в лабораторию живых пчел делают маз- ки-отпечатки из грудных мышц.

Возбудитель — Pseudomo-nas apisepticum — полиморфная, грамотрицательная, подвижная, не образующая спор, палочка Длиной 0,8—2 мкм, шириной 0,7—0,8 мкм (рис. ); факультативный аэроб, хорошо растет на обычных питательных средах (рН 7,2—7,4); оптимум роста 20—37 °С.

При микроскопическом исследовании поверхность хитинового покрова груди пчел дезинфицируют обжиганием, прокалывают перепонку между сегментами тонкой пастеровской пипеткой и набирают гемолимфу, из которой затем готовят мазки и производят посевы на питательные среды (МПА, МПБ). Мазки фиксируют на пламени горелки и красят по Граму. В положительном случае в мазках обнаруживают однородные грамотрицательные палочки.

Pseud, apisepticum на агаре образует крупные, с ровными краями мут- но-опаловые в центре и светлые к периферии маслянистые, легко смывающиеся колонии. При сплошном росте на агаре культура приобретает мутнозеленоватый оттенок и гнилостный запах; на пластинчатой желатине образуются колонии с глубоким центром разжижения, при посеве уколом желатина воронкообразно разжижается по ходу укола и выделяются пузырьки газа; на агаре Эндо формируются красные колонии, цвет среды не изменяется.

После получения чистой культуры изучают ее биохимические свойства на наборе питательных сред (среды с углеводами, желатина, молоко, МПБ с индикаторными бумажками для исследования на индол и сероводород, ломтик картофеля). Учет проводят через 1—2 сут. На картофеле вырастают хо-

19

рошо заметные, выпуклые, маслянистые колонии, постепенно темнеющие от бурого до почти черного цвета; буреет и сам картофель.

Pseud, apisepticum свертывает и пептонизирует молоко; образует кислоту, затем щелочь; выделяет сероводород; разлагает без образования газа, но с накоплением щелочи фруктозу, галактозу, маннозу, сорбит, глицерин, салицин; образует небольшое количество кислоты в средах с рафинозой, арабинозой, крахмалом, лактозой, изодульцитом; декстрин не разлагает, нитраты восстанавливает до нитритов; индола не образует.

ГАФНИОЗ. В лабораторию посылают живых больных или мертвых пчел. В лаборатории выделяют чистую культуру возбудителя болезни или ставят реакцию агглютинации.

Возбудитель — Hafnia alvei. Это бактерия, имеющая вид палочки с закругленными концами, длина ее 1—2 мкм, ширина 0,3—0,5 мкм; подвижная (перитрих), грамотрицательная, хорошо красится всеми анилиновыми красителями. Факультативный аэроб. Спор не образует. При 20 °С она хорошо растет на обычных и элективных питательных средах, ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, с образованием кислоты — арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит, рамнозу; не дает реакции с метилротом; образует ацетилметилкарбинол, сероводород; утилизирует цитрат аммония; декарбоксилирует лизин и орнитин; не гидролизирует аргинин; не ферментирует адонит, дульцит, инозит, инулин, лактозу, рафинозу, салицин, сахарозу, сорбит и эритрит; не дезаминирует фенилаланин; не разлагает дезоксирибонуклеазу, мочевину, крахмал; не выделяет индол; не разжижает желатину; не изменяет молоко.

Для получения культуры от каждой пробы берут по 10 пчел, помещают их на 30 с в 96 %-ный спирт, затем обсушивают на стерильной фильтровальной бумаге и вскрывают. Для этого пчелу пинцетом фиксируют за грудку, стерильной препаровальной иглой удаляют спинное полукольцо со стороны заднего грудного тергита и из грудных мышц делают посев на среду Эндо. Одновременно из мышц готовят два мазка на предметных стеклах, окрашивают один метиленовой синькой, второй по Граму и просматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа. Посевы выращивают при комнатной температуре (20 °С). На МПА бактерии гафнии растут в виде полупро-

20

зрачных, круглых, с ровными краями колоний, легко снимающихся петлей. Из колоний готовят мазки, красят по Граму, микроскопируют и сравнивают с микрофлорой мазков из грудных мышц. Грамотрицательные бактерии исследуют на подвижность. Подвижные грамотрицательные бактерии пересевают на МПА, а затем делают посевы на цветной ряд Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, сахарозой и сорбитом; на среду с цитратом аммония; в две пробирки со средой Кларка; в МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород и на желатину. Посевы бактерий на среде с цитратом аммония и в одной пробирке со средой Кларка выращивают при комнатной температуре, остальные — при 35 °С. С культурами, выращенными на среде Кларка при 35 °С, ставят реакцию с метилротом, а при 20 ° С — реакцию Фогес — Проскауэр на ацетилметилкарбинол. Желатину охлаждают.

Срок бактериологического исследования на гафниоз пчел 4 дня. Серологическая диагностика гафниоза пчел основана на постановке

реакции агглютинации возбудителя со специфической сывороткой. Для постановки реакции агглютинации необходимы:

а) стандартная культура Hafnia alvei (стандартный антиген);

б) гипериммунная сыворотка; ее получают от кроликов, для этого животному вводят внутривенно выращенную на МПА суточную культуру возбудителя в концентрации 3—5 млрд. микробных тел в 1 мл 4 раза через 5 дней в следующих количествах:

При первой инъекции — 0,5 мл, второй — 1 мл, третьей — 1 мл, четвертой — 1,5 мл. Через 7—10 дней после четвертой инъекции у кролика берут кровь и получают сыворотку; ее можно использовать в течение 10 мес при условии хранения в холодильнике при температуре 4 °С;

в) нормальная сыворотка кролика; г) физраствор, содержащий 0,85 % химически чистого натрия хлорида

и 0,5 % карболовой кислоты; д) исследуемый антиген — смыв бактериальной культуры, содержа-

щий 3—5 млрд. микробных тел в 1 мл. Для этого берут 20 пчел с признаками заболевания и помещают на 2—3 мин в стакан с углекислым газом. Затем берут гемолимфу тонким капилляром, который вводят сбоку между 3 и 4 тергитами брюшка и высевают на МПА. Посевы выращивают в течение суток при 35 °С.