14_Laboratornaya_diagnostika_TB_Molekulyarno_geneticheskie_metody
.pdf14 Лабораторная диагностика ТБ. Молекулярно-генетические методы (GeneXpert, TB-Lamp, проба на стрипах) – описание методов, преимущества, недостатки, ограничения.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из наиболее быстрых и информативных методов выявления МБТ
Принцип метода состоит в увеличении в 106—108 раз числа копий специфического участка ДНК МБТ, катализируемого in vitroRH К-полимеразой в автоматическом режиме В искусственных условиях воспроизведение процесса репликации специфического или определенного вида или рода возбудителей участка генома возможно при условии знания его нуклеотидной последовательности Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликоны) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе. Метод обладает высокой чувствительностью – он позволяет обнаруживать возбудитель при содержании всего нескольких сотен микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала (мокроты, крови, плеврального выпота и т.д.) Результат исследования можно получить в течение 5–6 ч.
Этот высокочувствительный метод в ряде случаев может давать ложноположительные результаты, что ограничивает достоверность исследования.
Достоинства метода ПЦР
Прямое определение наличия возбудителей
Быстрота проведения анализа ПЦР можно проводить с любым диагностическим
материалом
Высокая специфичность
Высокая чувствительность
Внедрение ПЦР позволило: значительно сократить сроки подтверждения диагноза туберкулеза контролировать эффективность химиотерапии у больных туберкулезом
Тест - система «GeneXpert» - ЗОЛОТОЙ СТАНДАРТ - автоматизирования система ПЦР -диагностики туберкулеза. Позволяет обнаружить ДНК микобактерии туберкулеза и определить наличие гена устойчивости к рифампицину в течении 2-х часов. Необх конц МБТ 1000/мл. Метод дорогостоящий, но на сегодняшний устойчивости МБТ.
Система GeneXpert Dx предназначена для проведения диагностики in vitro и включает автоматизированную очистку образцов, амплификацию нуклеиновых кислот и определение интересующей последовательности в простых или сложных образцах с использованием методов ПЦР в реальном времени и ПЦР с обратной транскриптазой. Система состоит из диагностического устройства, персонального компьютера, сканера штриховых кодов и программного обеспечения для проведения тестов и просмотра их результатов. Система требует использования одноразовых картриджей, содержащих реагенты для ПЦР, в которых и происходит реакция. Поскольку картриджи являются автономными, перекрестная контаминация образцов исключена. Результаты тестов предоставляются в графическом, табличном и цифровом форматах.
Прибор GeneXpert Dx оснащен независимыми амплификационными модулями, предназначенными для загрузки различных диагностических картриджей GeneXpert. После загрузки картриджа, прибор автоматически производит подготовку образца, амплификацию, обнаружение искомой последовательности нуклеиновой кислоты и предоставление результата.
Основные преимущества системы GeneXpert:
простота и удобство в работе
высокая скорость получения результатов
автоматизированная подготовка образцов
высокая точность получаемых результатов
исключена контаминация на любой стадии работы прибора
система с произвольным доступом – возможность постановки теста в любое время
Сама тест-система GeneXpert представляет собой полуколичественную гнездовую ПЦР, реакция проводится в картридже, для определения ДНК микобактерий туберкулеза в образцах мокроты. Также при помощи GeneXpert диагностики выявляются мутации устойчивости к рифампицину в тех образцах, получают от пациентов, у которых возможен риск развития устойчивости к данному лечебному препарату. Современная диагностическая система GeneXpert – это система закрытого типа, все диагностические мероприятия – определение, выделение проводят в одноразовом картридже, за счет чего предварительной обработки исследуемого материала не требуется, а это позволяет по максимуму избежать контаминации этого материала. По многочисленным клиническим исследованиям устойчивость к рифампицину обычно взаимосвязана с устойчивостью и к изониазиду, а это требует проводить полный диагностический тест к препаратам 1 — 2 ряда. Диагностика проводится только после выделения микобактерий туберкулеза. Затем результат диагностики обрабатывается на ПК и проясняет клиническую картину для решения вопросов лечения данного больного.
К недостаткам этого метода исследования относится тот факт, что определить устойчивость возбудителя возможно только к одному препарату рифампицину, а это ведет к необходимости дальнейшей диагностики, чтобы определить мультирезистентность. Недостатком есть то, что для исследования возможно только использования мокроты и в современном мире ведутся работы, чтобы обеспечить возможность применения других биологических материалов, метод диагностики является достаточно дорогостоящим удовольствием, из-за этого имеет свои ограничения. Чаще всего такой метод проводят для обследования населения такой группы: ВИЧ инфицированные, лица, который имели тесный контакт с туберкулезным больным и ранее пролеченные больные.
Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) является новым методом амплификации нуклеиновых кислот, который был разработан в 2000 г. Сущность данного метода заключается в удвоении участка ДНК с высокой специфичностью, эффективностью и скоростью в условиях постоянной температуры. Позволяет проводить типизацию МБТ, МЛУ/нет.
При использовании технологии LAMP амплификацию ДНК и детекцию гена можно выполнить за один шаг. Для теста не требуются сложные приборы, и он может применяться на уровне периферийных медицинских центров (расположенных вблизи места обращения пациентов за помощью, а не в центральной лаборатории) при условии выполнения требований по биологической безопасности, аналогичных таковым для микроскопии мокроты.
Преимущества
Быстрый – получение результатов занимает меньше часа
Низкий уровень биологической безопасности, аналогичный таковому для микроскопии
Более чувствителен, чем микроскопия мокроты (на 15% больше пациентов)
Более доступное по цене оборудование, чем GeneXpert
Недостатки
Не позволяет дифференцировать ЛУ-ТБ от ЛЧ-ТБ
Менее специфичен, чем микроскопия мокроты – больше ложноположительных результатов (у большего числа людей определяется наличие ТБ, в то время как ТБ у них нет)
Менее чувствителен, чем GeneXpert
Как и GeneXpert, НЕ может применяться для мониторинга терапии, поскольку не может различить живые и мертвые бактерии. Как следствие, для контроля терапии все еще необходима микроскопия мокроты
Процедура теста с помощью TB-LAMP предусматривает несколько этапов, выполняемых вручную (примерно 10), некоторые из которых занимают много времени и усилийспециалистов. Таким образом, нужны вложения в подготовку специалистов.
DNA-STRIP технология.Принцип метода На ДНК-стрипы нанесены специфические пробы, которые комплементарны амплифицируемым нуклеиновым кислотам (ампликонам). После денатурации одноцепочечные ампликоны специфически связываются с пробами на стрипах (гибридизация) и затем визуализируются в последовательной энзиматической реакции (со стрептавидином и щелочной фосфатазой).
ДНК-стрипы GenoType = Hain test .Метод позволяет определять ЛУ к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, этамбутолу, аминогликозидам/циклическим пептидам, возможность идентифицировать вид МБ, Рез-т 5 дней.
Метод основан на множественной обратной гибридизации на ДНК-стрипах и лежит в основе тестсистемы GenoType MTBDRplus, применяемой для определения ЛЧ к изониазиду и рифампицину, и тест-системы GenoType MTBDRsl для определения ЛУ к фторхинолонам, аминогликозидам/циклическим пептидам и этамбутолу. После одноэтапной амплификации со специфическими праймерами продукты ПЦР гибридизуются с олигонуклеотидами, иммобилизованными на стрипах. Гибридизация ампликонов проходит в открытых ванночках, что увеличивает риск контаминации. Результат гибридизации визуализируется на нейлоновой мембране – стрипе в виде набора полос, которые вручную или с помощью прибора сравнивают с шаблоном и определяют наличие мутаций, ассоциированных с ЛУ.