Фармакогностическое изучение растений рода тимьян (Thymus L.) как перспективного источника получения фитопрепаратов

301

Выводы по главе 4

1.Установлены морфологические признаки сырья 7 видов тимьянов,

произрастающих на территории средней полосы России, позволяющие проводить диагностику сырья морфологически близких видов: это поперечное сечение стебля; характер опушения стебля; форма листьев;

наличие черешка; характеристика соцветия; направление волосков на цветоножке; опушение чашечки; характеристика зубцов верхней губы чашечки.

2.Проведенные анатомические исследования позволили выявить микродиагностические признаки сырья, которыми являются опушение стебля, листа, чашечки и венчика простыми и головчатыми волосками.

Диагностическое значение имеют также выросты клеток эпидермиса и наличия кристаллов в трубке венчика, наличие и расположение эфиро-

масличных железок.

302

ГЛАВА 5 СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ

СЫРЬЯ РАСТЕНИЙ РОДА ТИМЬЯН

В современном мире все более возрастают требования, предъявляемые к качеству лекарственного растительного сырья, что делает необходимым совершенствование его стандартизации [3, 21, 215, 216, 237, 238]. ФС «Трава чабреца», включенная в ГФ ХI издания, не отвечает требованиям времени,

которые предъявляются к нормативной документации на лекарственное растительное сырье. Это связано с тем, что она не содержит методик качественного и количественного определения действующих веществ, что в свою очередь не позволяет оценивать качество сырья чабреца. Качество сырья тимьяна ползучего статья Государственной фармакопеи XI издания оценивала только по содержанию экстрактивных веществ [83]. Согласно требованиям ОСТ 91500.05. 001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения», в нормативную документацию должны включаться определение подлинности и показателей качества не только для цельного и измельченного сырья, но и для порошка, который используется для изготовления лекарственных средств. Цельное, измельченное сырьѐ и порошок должны быть включены в разделы «Внешние признаки», «Микроскопия», «Числовые показатели».

В связи с чем, нами была предпринята попытка приведения к современным требованиям фармакопейной статьи «Трава чабреца».

Проведенные нами исследования, а также данные литературы показали, что основными группами биологически активных веществ травы тимьянов наряду с эфирным маслом, являются фенольные соединения (флавоноиды и гидроксикоричные кислоты), поэтому стандартизация сырья была осуществлена по содержанию флавоноидов и показана возможность использования для этой цели и гидроксикоричных кислот.

303

5.1Стандартизация сырья растений рода тимьян

всоответствии с содержанием флавоноидов Качественное определение флавоноидов в чабреце трава

Для определения подлинности лекарственного растительного сырья используют качественные реакции, а также методы хроматографии, в частности хроматографию в тонком слое сорбента. Метод хроматографии в тонком слое сорбента при использовании его для анализа лекарственного растительного сырья, характеризуется рядом преимуществ: селективностью, высокой

чувствительностью, быстротой проведения анализа, устойчивостью

хроматограмм к действию агрессивных проявителей и др. [26, 131]. В связи с чем, за основу метода обнаружения флавоноидов в сырье чабреца нами был применен метод тонкослойной хроматографии.

Для качественного определения флавоноидов были использованы пластинки «Sorbfil» (ПТСХ-АФ-А-УФ). Первоначально разделение суммы флавоноидов в траве чабреца проводили в 12 системах растворителей, наиболее часто используемых для этих целей: кислота уксусная–вода - спирт бутиловый

(5:10:85), бензол-спирт этиловый (95:5), ацетон – бензол (1:4), бензол-спирт

этиловый-толуол (4:2:2), хлороформ–спирт метиловый (3:1), хлороформ–спирт метиловый-вода очищенная (26:14:3), кислота уксусная–вода очищенная-

этилацетат (2:1:10), кислота муравьиная-вода очищенная-этилацетат (15:15:70)

[26]. Наилучшее разделение суммы флавоноидов в траве чабреца наблюдается в системе растворителей: кислота муравьиная-вода очищенная-этилацетат

(15:15:70). Для нанесения на хроматограмму было использовано водно-

спиртовое извлечение, приготовленное для определения количественного содержания суммы флавоноидов. Водно-спиртовое извлечение наносили в различных объемах от 0,01мл до 0,05 мл. На хроматограмме наилучшее

304

разделение веществ происходит при использовании объема 0,02 мл извлечения. В качестве образца сравнения был использован стандартный образец цинарозида 0,1% раствор [20, 131].

Методика качественного обнаружения флавоноидов

в траве чабреца

На стартовую линию хроматографической пластинки «Sorbfil» (ПТСХ-

АФ-А-УФ) 7,5 х 15 мм наносят 20 мкл (0,02 мл) полученного извлечения из травы чабреца (см. раздел "Количественное определение флавоноидов"), рядом 5 мкл (0,005 мл) стандартного образца цинарозида 0,1 % раствора. Пластинку высушивают на воздухе 5 минут, помещают в камеру с залитой системой растворителей: кислота муравьиная-вода очищенная-этилацетат (15:15:70) и проводят хроматографирование восходящим способом (смесь растворителей используют свежеприготовленной и вносят в камеру перед хроматографированием непосредственно).

При прохождении фронта растворителя до конца пластинки, пластинку вынимают, сушат в вытяжном шкафу до удаления запаха растворителей, далее обрабатывают спиртовым раствором алюминия хлорида 2 %, высушивают.

На хроматограмме стандартного образца цинарозида должна обнаруживаться желтая зона.

На хроматограмме испытуемого раствора должна обнаруживаться зона адсорбции с флуоресценцией желтого цвета на уровне зоны адсорбции стандартного образца цинарозида и 3 зоны адсорбции желтого цвета ниже (рисунок 224, Приложение №2, №3, №4).

Допускается наличие других зон адсорбции .

305

Рисунок 224 - Рисунок

хроматограммы водноспиртового извлечения из травы чабреца

Система растворителей: кислота муравьиная-вода очищенная-этилацетат

(15:15:70)

(фото автора)

При проведении валидации методики оценивали специфичность хроматографической системы. Специфичность методики заключалась в совпадении результатов хроматографических исследований основных зон между собой для разных образцов сырья, заготовка которых проводилась в течение нескольких лет и соответствию описанию методики.

Были исследованы 5 образцов сырья чабреца (таблица 43). Критерий приемлемости методики выражался в совпадении зон адсорбции разных образцов сырья чабреца и соответствие данных зон описанию методики.

Хроматографические зоны исследуемых образцов сырья чабреца были одинаковыми по основной зоне и совпадали с описанием методики.

Разработанная методика дает возможность четко дифференцировать зоны в изучаемых видах сырья, которые соответствуют по цвету стандартному образцу

- раствору цинарозида, а также, расстоянию пройденному пятну от линии старта.

Количественный анализ флавоноидов в сырье растений рода тимьян

Определение содержания флавоноидов в лекарственном растительном

сырье проводят различными методами: весовыми, флюорометрическими,

306

объемными, полярографическими, фотоколориметрическими,

спектрофотометрическими [32, 33, 118, 301]. Наиболее распространенным среди них является комбинированный метод, сочетающий определение флавоноидов методом спектрофотометрии в УФ-области спектра с методом хроматографии на бумаге [29, 145, 275] или в тонких слоях сорбента [29]. Для определения флавоноидов в видимой области спектра с помощью спектрофотометрии и фотоэлектроколориметрии используют реакцию с хромогенными реактивами [30, 145, 162, 301]. Широко распространенной для этих целей является реакция комплексообразования с алюминия хлоридом [31, 33, 43, 78].

Для анализа травы тимьяна ползучего нами была разработана методика определения суммы флавоноидов с использованием спектрофотометрии.

Данная методика основана на реакции комплексообразования с алюминия хлоридом с использованием дифференциального спектрофотометрического метода определения оптической плотности полученных комплексов. Благодаря этому приему можно проводить спектрофотометрирование полученного комплекса флавоноидов с алюминия хлоридом непосредственно в извлечении из сырья, не применяя дополнительных стадий очистки [33, 78, 232, 283, 298].

К основным этапам для разработки методик количественного анализа относятся:

Изучение процесса экстрагирования;

Сравнение спектров поглощения полученных извлечений из сырья без алюминия хлорида и после использования реакции с алюминия хлоридом, что позволяет определить степень влияния на спектральные характеристики сопутствующих веществ;

Изучение оптимальных параметров реакции комплексообразования.

Важной стадией в процессе количественного анализа флавоноидов

является экстракция.

307

На процесс экстрагирования флавоноидов из растительного сырья влияет измельченность сырья, время экстрагирования, температура экстракции,

экстрагент, применяемый для экстракции, соотношение сырье-экстрагент.

Измельченность сырья – важный фактор, влияющий на экстрагирование флавоноидов из растительного сырья. В литературе в качестве оптимальных значений степени измельченности приводится степень измельчения 0,5-2 мм

[198]. Результаты выхода флавоноидов в зависимости от степени измельченности лекарственного растительного сырья показаны в таблице 32.

Таблица 32 – Выход суммы флавоноидов в зависимости от степени измельченности сырья

Флавоноиды максимально экстрагируются из травы тимьяна ползучего при степени измельченности сырья 2 мм.

В литературе имеются данные, что экстрагирование флавоноидов из лекарственного растительного сырья проводится с использованием водно-

спиртовых растворов. При изучении оптимального экстрагента для извлечения флавоноидов нами использованы: вода очищенная, спирт этиловый 96% и

водно-спиртовые растворы (таблица 33).

Таблица 33 – Результаты выбора экстрагента для извлечения флавоноидов из сырья тимьяна ползучего

308

Проведенные исследования позволили выбрать оптимальный экстрагент,

который обеспечивает максимальный выход флавоноидов из травы тимьяна

ползучего, это спирт этиловый 70%.

В литературе описаны различные виды экстракции для извлечения флавоноидов, такие как экстрагирование с использованием аппарата Сокслета,

экстрагирование кипящими спиртами различной концентрации 50-95%. Нами было применено экстрагирование до наступления равновесия. [198] При изучении динамики экстрагирования флавоноидов из измельченного сырья чабреца при использовании в качестве экстрагента спирта 70% и соотношении сырье-экстрагент 1:100 установили, что максимальный выход флавоноидов наблюдается через 60 минут с дальнейшим наступлением равновесия (таблица

34).

Таблица 34 – Результаты определения времени экстрагирования флавоноидов из травы тимьяна ползучего

В основе спектрофотометрического определения флавоноидов лежат различные реакции, но чаще всего используются реакции образования комплексов с циркония хлорокисью и алюминия хлоридом [31, 32, 253]. В

качестве комплексообразователя нами был использован алюминия хлорид.

Алюминия хлорид относится к доступным реактивам, он хорошо растворяется в спиртах и воде очищенной.

При разработке оптимальных условий образования комплексов с алюминия хлоридом установлено, что наилучшие результаты достигаются при использовании 5 мл раствора алюминия хлорида 5%, что мы и использовали в дальнейших исследованиях (таблицы 35, 36).

309

Таблица 35 - Влияние концентрации алюминия хлорида на содержание

флавоноидных соединений

Таблица 36 - Влияние объема алюминия хлорида 5% раствора на содержание флавоноидных соединений

Для выявления максимума поглощения для спектрофотометрического определения нами были изучены спектры поглощения водно-спиртового извлечения из травы тимьяна ползучего (рисунок 224) с 5% раствором алюминия хлорида. Полученный спектр поглощения показал, это изучаемое извлечение с алюминия хлоридом имеет максимум поглощения при длине волны 395 нм. В данной области спектра не наблюдается влияния сопутствующих веществ (фенольных и других органических), содержащихся в извлечении из сырья чабреца.

Исследование химического состава травы растений рода тимьян,

представленного в главе 3 позволило установить в ней наличие гликозидов апигенина, лютеолина и преобладающим среди них является цинарозид.

Сравнение спектров поглощения водно-спиртовых извлечений из сырья тимьяна ползучего (чабреца) с алюминия хлоридом и цинарозида с алюминия хлоридом показало, что они совпадают, поэтому в качестве стандартного образца нами выбран цинарозид (рисунок 225).

310