Выделение нуклеиновых кислот
Прежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить содержащую ее суммарную ДНК
Фенольный метод выделения ДНК
Нейтраль
ные
значения pH
Водная
фаза (ДНК и
Денатурирова РНК)нные белки
Фенольная
фаза
Кислые
значения pH
Водная
фаза
(РНК)
Фенольная фаза (ДНК)
Взаимодействие ДНК с поверхностью стекла
Сорбция: кислые pH, высокая ионная сила
Элюирование: щелочные pH, низкая ионная сила
Гуанидинизотиоц
ианат
Щелочной метод выделения бактериальных плазмид
pH 8,0 |
pH 12,0 |
pH 8,0 |
Фрагменты |
Кольца |
Линейная |
линейной |
плазмидной |
ДНК |
ДНК и |
ДНК остаются |
агрегирует, |
кольцевая |
зацепленными |
кольцевая |
плазмидная |
друг за друга |
восстанавлив |
ДНК |
|
ается |
Формы
плазмидной ДНК
Суперскрученная
Одно- цепочечный разрыв ДНК
EcoRI
ЛинейнаяКольцевая ковалентно- |
Релаксированная |
замкнутая |
|
Электрофоретическая подвижность |
|
|
разных форм плазмиды в присутствии |
|
|
|
бромистого этидия |
|
|
Увеличение отношения EtBr/Д |
|
|
Предел |
- |
|
визуальной |
|
|
чувствительнос |
|
Релакс |
ти – |
- |
50 нг |
||
|
Линейная |
|
|
ДНК/полоса |
|
0
Супер.
+
Бромистый этидий |
+ |
|
Сортировка микрочастиц в четырехпараметрическом проточном цитометре
б |
Буферный |
Создание электрического |
|
"Зеленый" сигнал |
||
|
раствор |
заряда на каплях |
ФЭУ |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
Суспензия |
Зеленый |
Оранжевый |
|
||
|
хромосом |
|
фильтр |
|
||
|
|
фильтр |
|
|||
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
ФЭУ |
"Оранжевый" |
|
|
|
|
|
сигнал |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ФЭУ |
Сигнал "Бокового |
|
|
|
|
|
светорассеяния" |
||
|
|
|
|
|
||
|
Проточная |
|
|
Голубой |
|
|
|
кювета |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
фильтр |
|
|
|
|
|
PD |
Сигнал "Прямого |
|
|
|
Лазер |
|
светорассеяния" |
|
||
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
Отклоняющие |
|
Голубой |
|
|
|
|
|
фильтр |
|
|
|
|
|
пластины |
|
|
|
|
|
ЭВМ
Пример разделения метафазных хромосом человека с помощью двухлазерного проточного цитометра
г |
Область |
|
сортировки |
|
|
Интенсивность флуоресценции (Хёхст 33258)
Интенсивность флуоресценции (Хромомицин А3)
FACS (fluorescence- activated cell (chromosome) sorting
до 105 частиц/мл
суспензиирассеянный свет: форма,
размер и состав (по преломлению света) т.е. метаболическое состояние клетокчисло фотодетекторов
определяет кол-во измеряемых параметров (обычно 5-6)
Хёхст 33258 – AT-пары
хромомицин A3 – GC-парыразделение
гомологичных хромосом
19 и 21 родителей
Первые два класса систем рестрикции-модификации
Метил- трансфераза
Рестриктаза 
Хеликаза
Специфичн
ость взаимодей- ствия с ДНК
Подчеркнуты
метилируемые
нуклеотиды
Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент генной инженерии
Узнают специфические
последовательности – сайты рестрикции
Активны в виде димеров в
присутствии ионов Mg2+
В ДНК-ферментном комплексе до трех ионов Mg2+, координированных двумя остатками Asp и одним атомом кислорода фосфатной группы ДНК вблизи точки разрыва фосфодиэфирной связи. Облегчает атаку молекулой воды атома фосфора