Тема II

Репликация и транскрипция вирусных геномов посредством днк-зависимого синтеза рнк.

Лекция 9

Репликация и транскрипция ретровирусов

Крупные вирусы, Ø 100 нм, обладающие мембранной оболочкой. Единственная группа вирусов с диплоидным геномом: содержат две одноцепочечные +РНК длиной около 10000 нт кэпированные и полиаденилированные. Концы молекул РНК имеют сайты димеризации. В вирусной частице обнаруживаются также несколько видов тРНК, один из которых специфичен для определенных групп ретровирусов. Вместе с РНК в вирусной частице содержится обратная транскриптаза (ревертаза) – фермент, осуществляющий синтез РНК на матрице ДНК. Ниже представлена схема воспроизведения генома ретровирусов.

-ДНК

+РНК

± ДНК

Геномы ретровирусов можно разделить на простые и сложные. В простых геномах содержатся гены, кодирующие белки капсида (gag), ферменты, необходимые для размножения вируса: полимеразу, интегразу (pol), и белки оболочки (env). В сложных геномах помимо перечисленных генов, содержатся дополнительные, как правило, регуляторные гены. Например, у вируса клеточного лейкоза на – цепи закодирован регулятор транскрипции.

При заражении клетки внутрь проникает рибонуклеопротеид. Ревертаза и РНК изолированы от цитоплазмы белковой оболочкой капсида.

Ревертаза ретровирусов. Обнаружена тридцать лет назад. Обладает активностями

1)ДНК-зависимой РНК-полимеразы;

2)ДНК-зависимой ДНК-полимеразы;

3)РНКазыН;

4)интегразы.

По структуре ревертаза похожа на клеточную ДНК-зависимую ДНК-полимеразу. В экспериментальных условиях удается заставить ДНК-полимеразы синтезировать ДНК на матрице РНК, но в физиологических условиях ДНК-полимеразы специфичны к матрице ДНК, тогда как ревертаза к матрице не специфична.

Фермент функционирует в виде гетеродимера; обе субъединицы, являются сплайсформами и отличаются только длиной N-концевого домена.

Синтез нуклеиновой кислоты ревертаза осуществляет с помощью затравки. Как решается проблема репликации 3’-конца?

Рассмотрим механизм репликации ретровирусов.

Общая структура +РНК ретровирусов

5’

3’

U₃ r

r U₅ PBS

PBS – Primer Binding site

r – концевой повтор длиной 12 – 250 нт.

U₃ – уникальная для 3’-конца последовательность длиной 20(?)-1200 нт.

U₅ – уникальная для 5’-конца последовательность длиной 80 – 200 нт.

Синтез первой цепи ДНК происходит внутри капсида, и праймером для ревертазы служит тРНК, которая комплементарно связывается с участком PBS. У каждой группы ретровирусов в качестве праймера используется определенная, специфичная для этой группы тРНК. Белок капсида обладает РНК связывающей и РНК-хеликазной активностями, он расплавляет тРНК, чем способствует ее отжигу на PBS. В отжиге тРНК может участвовать соответствующая аминоацил-тРНК-синтетаза, которая иногда захватывается вирусом. В случае вируса птичьей саркомы показано, что тРНК может взаимодействовать и с другими участками генома. Ниже приведена модель такого взаимодействия. Считается, что при этом стабилизируется расплавленное состояние PBS.

PBS

_

Результатом удлинения затравки является фрагмент ДНК длиной ~ 100 нт. Синтез идет до конца матрицы – run off. (strong stop DNA). Этот фрагмент является мажорным продуктом работы ревертазы.

r U₅

r U₅

+

_

После синтеза фрагмента ДНК ревертаза проявляет активность РНКазы Н и удаляет РНК в гетеродуплексе с ДНК, кроме участка связывания тРНК.

r U₅

+

_

I прыжок. 3’-конец фрагмента ДНК комплементарен 5’-концу РНК (т.к. это участок r), поэтому происходит гибридизация этих участков. На схеме это выглядит как прыжок.

r U₅

+

_

3’-конец фрагмента ДНК служит затравкой для ревертазы. Синтезируется длинный фрагмент ДНК.

U₃ r U₅

+

_

Ревертаза вновь проявляет активность РНКазы Н, но удаляет не всю РНК: остается участок, богатый пуринами, (полипуриновый тракт)

U₃ r U₅

P

рр

BS

+

_

Полипуриновый тракт используется как затравка. В ходе синтеза ДНК происходит смена матрицы – ревертаза переходит на тРНК. Однако, фермент останавливается на метилированных основаниях (DNA strong stop) и может синтезировать только участок PBS .

U₃ r U₅

рр

U₃ r U₅ PBS

PBS

+

РНКазаН удаляет тРНК и полипуриновый тракт. Удаление полипуринового тракта происходит хитрым образом: ревертаза синтезирует короткий фрагмент ДНК (около 16 н.т.), возвращается и разрывает связь между первым дезоксинуклеотидом и последним нуклеотидом тракта.

_

U₃ r U₅

U₃ r U₅ PBS

PBS

+

_

U₃ r U₅

II прыжок. Фрагмент + цепи ДНК за счет PBS «перепрыгивает» на 3’конец –цепи и происходит достройка обоих цепей. Образуется линейная двуцепочечная ДНК.

U₃ r U₅ PBS

+

Последний этап синтеза д.ц.ДНК можно представить иначе, если принять что происходит «циклизация» -цепи за счет фрагмента + цепи.

U₃

r

U₅

PBS

U₃

r

U₅

PBS

В пользу этой схемы говорят данные об обнаружении кольцевых форм ДНК, причем двух типов.

U₃

r

U₅

U₃

r

U₅

U₅

r

U₃

Полагают, что причиной их появления может быть рекомбинация между участками r. Роль кольцевых форм в цикле воспроизводства ретровирусов не ясна.

Отступление. Давно замечено, что существуют пермиссивные (чувствительные) и непермиссивные (устойчивые) по отношению к ретровирусам клетки. Устойчивость связана с наличием фермента – дезаминазы дезоксицитидиловых нуклеотидов (APOBEC 3G). Этот фермент обусловливает большую изменчивость иммуноглобулинов и аполипопротеина. У ретровирусов существует защита от этого фермента – белок VIF. Он имеет убиквитинлигазную активность и инактивирует дезаминазу, направляя ее с помощью убиквитина в протеасому. VIF также блокирует включение APOBEC 3G в капсид. Если по каким-либо причинам ген этого белка не экспрессируется, то вирус не размножается в клетках, содержащих APOBEC 3G. Другой ген устойчивости к дезаминазе кодирует урацил-ДНК-гликозилазу, выщепляющую продукты ее действия.

Известно, что у ретровирусов высокая степень изменчивости, что может быть обусловлено действием дезаминазы и высокой частотой рекомбинации (поскольку геном диплоиден, то ревертаза может менять матрицу, переходя от одной цепи к другой).

Непонятно как размножаются лентивирусы, не имеющие гена vif.

Следующая стадия цикла размножения ретровирусов – интеграция в геном клетки-хозяина.

В цитоплазме находится прединтеграционный комплекс, содержащий интегразу, белок М и т.д, только необходимо проникнуть в ядро. Поскольку комплекс большой, то пройти через ядерные поры не удается, поэтому некоторые ретровирусы могут интегрироваться в геном только когда ядерная мембрана разрушена, т.е. когда клетка делится. Однако, HIV может размножаться и в неделящихся клетках. Специальный вирусный белок VPR взаимодействует с системой импортинов (в частности с кариофилином) и увеличивает сродство к М-белку комплекса, имеющего аж два NLS сигнала. Для транспорта привлекаются шапероны, например HSP70.

Механизм интеграции.

Осуществляется интегразой. Ее функцию может выполнять полимераза или это отдельный белок, функционирующий в виде тетрамера. В последнем случае с каждым концом ДНК вируса, связывается по димеру интегразы. Интеграции способствуют следующие факторы: 1)начало транскрицпии; 2)необычные структуры ДНК (деформации спирали).

Интеграция происходит неспецифически, без инверсии и сопровождается двумя геномными изменениями: концы вирусной ДНК теряют по ТТ и фланкируются повторами клеточной ДНК.

Перед встраиванием димеры интегразы объединяются и, таким образом, за счет белок-белковых взаимодействий ДНК нековалентно циклизуется. Интеграза удаляет с 3'-концов по ТТ, это механизм предотвращения самоинтеграции.

Изучение in vitro: иметь плазмиду со встроенным фагом и смесь нужных белков.

ДНК вируса компактизована с участием клеточных белков: HMG A1, BAF (Barrier for Autointegration Factor).

Приблизившись к участку геномной ДНК хозяина, интеграза вносит одноцепочечные разрывы в обе цепи на расстоянии 4-6 нт. Происходит соединение ДНК вируса и клетки, репарация бреши, с удалением 5'-концевых AA.

CATT 3' 5' AATG

GTAA 5' 3' TTAC

3' 5'

5' 3'

5'

3'

3'

5'

U₃ r U₅

U₃ r U₅

Транскипция аденовирусов.

Основные элементы, необходимые для транскрипции есть изначально, но синтез мРНК начинается только после интеграции вируса. Может влияет структура?

Транскрипция идет вправо от r до r. Регуляторные элементы (TATA, инициатор UAS) находятся в U₃, но почему работает только левый промотор, а правый молчит? Полиаденилирование также происходит только на правом конце.

Есть предположение, что влияют внутригеномные элементы, такие элементы известны в случае лентивирусов у других пока не известно. Может влияет клеточное окружение.

Если ввести сильный терминирующий сигнал между правым и левым промоторами, то включается правый. Правый промотор "знает", что делает левый. Видимо, транскрипция с левого промотора блокирует работу правого промотора. Проблема изучена плохо.

Полиаденилирование.

Вирус рака молочных желез.

Уровень транскрипции зависит от гормонального состояния организма, например, от количества глюкокортикоидов.

Энхансерные элементы зарепрессированы и их активация происходит при лактации. В активации участвуют oct1, oct2, remodeling factors, CDP (CC displasment protein), блокирует взаимодействие рецепторов глюкокортикоидов (цитоплазматические белки) с энхансерными элементами.

HIV.

TAT белок (TransAcTivator) 86 а.к., содержит два домена: РНК-связывающий и активирующий.

На 5’-конце в R области транскриптов имеется несовершенная шпилька – элемент TAR. Присоединившись к этой структуре белок активирует транскрипцию.

Петля на самом деле представляет собой организованную структуру. Размер выпетливания (bulch) 3 нт.

TAT привлекает к TAR позитивный фактор элонгации транскрипции – pTEF, в факторе находятся циклин-зависимая протеинкиназа – CDK9 и ее активатор – циклин Т1. Показано, что при фосфорилировании РНК-полимеразы II увеличивается ее процессивность. Среди киназ, фосфорилирующих РНК-полимеразу II, обнаружена TAK – TAT activated kinase. ТАТ привлекает также компонент ситемы перемоделирования хроматина р300/СВР (ацетилаза).

Каким образом связывание TAT-белка приводит к активации транскрипции? Предположено, что когда появляется эта шпилька, белок связывется с ней и привлекает факторы транскрипции. Таким образом, облегчается синтез последующих мРНК. Активация промотора позади транскрипционного комплекса.

В отсутствии ТАТ белка TAR-элемент взаимодействует с РНК-полимеразой и это снижает ее активность.

ТАТ может действовать независимо от TAR-элемента.

Он активирует PKR – интерферон индуцируемую протеинкиназу, фосфорилирующую α-субъединицу фактора инициации трансляции – eIFα, она также фосфорилирует IκB – ингибитор фактора транскрипции NFκB. В фосфорилированной форме ингибитор направляется на разрушение по убиквитин-протеосомальному пути. Фактор транскрипции из цитозоля импортируется в ядро, где активирует ряд генов, в том числе и гены вируса HIV.

ТАТ активирует кэпирующий комплекс и тем самым стимулирует кэпирование мРНК.

Есть данные о том, что ТАТ стимулирует обратную транскрипцию.

ТАТ обладает последовательностью, позволяющей ему войти в клеткку. Он используется как шаттл-белок для транспорта других белков.

ТАТ взаимодействует с белками тубулина, нарушая архитектуру цитоскелета, он провоцирует клетку уйти в апоптоз.

ТАТ стимулирует посадку тРНК на PBS-сайт.

ТАТ участвует в упаковке вирусных частиц.

Другие регуляторы.

Nef. Вкючает киназный каскад, работает только в системе целого организма.

VPR. Стимулирует транскрипцию ДНК неинтегрировавшегося вируса. Связывается с р300/СВР.

HTLV-1(вирус клеточного лейкоза).